經(jīng)限制性酶酶切的DNA片段或基因，不能直接進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行克隆的。一個(gè)DNA片段只有與適合的載體(vector)DNA鏈接構(gòu)成重組DNA分子，才能進(jìn)入宿主細(xì)胞(host cell)，并在其中復(fù)制、擴(kuò)增,克隆出多個(gè)拷貝。
    可作為DNA載體的有質(zhì)粒,噬菌體,病毒,細(xì)菌或酵母菌人工染色體BAC,HAC等?，F(xiàn)在使用的各種載體都是用基因工程方法構(gòu)建的。作為載體DNA 分子,需要具備以下4個(gè)條件:
①具復(fù)制原點(diǎn)(ori),在宿主細(xì)胞中不僅能獨(dú)立地自我復(fù)制,而且能帶動(dòng)攜帶的外源DNA片段一起復(fù)制。
②具有多個(gè)克隆位點(diǎn)(multiple cloning site,MCS,或稱polylinker region),即具有多種限制性酶的切點(diǎn),而每一種酶的切點(diǎn)只有一個(gè),用于克隆外源DNA 片段。這些酶切位點(diǎn)不存在于復(fù)制原點(diǎn)或抗性選擇標(biāo)記基因內(nèi),以保持載體的自主復(fù)制特性及表型標(biāo)記性狀。
③至少具有一個(gè)選擇標(biāo)記基因,這個(gè)基因通常是抗菌素的抗性基因或某種酶的基因,而宿主細(xì)胞則沒有這種基因,使有或無載體的宿主細(xì)胞具有易鑒別的表型。
④易從宿主細(xì)胞中吸收。
㈠細(xì)菌質(zhì)粒
    質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于細(xì)菌染色體而自然存在的,能自我復(fù)制,易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈DNA分子。早期用于基因工程的載體是遺傳改良的細(xì)菌質(zhì)粒,他們僅能用于克隆分子量小于10Kb(1000bp=1kb)的外源DNA片段。這些質(zhì)粒的適應(yīng)范圍廣,拷貝數(shù)多。盡管在轉(zhuǎn)化時(shí)僅一個(gè)質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞,但復(fù)制之后每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)可高達(dá)1000個(gè)。這一特點(diǎn)十分有利于大量擴(kuò)增克隆的DNA的片段,作為克隆載體應(yīng)用。
現(xiàn)在廣泛使用且商品化的質(zhì)粒,很多都具有重組表型檢測標(biāo)記,在DNA克隆中根據(jù)宿主細(xì)胞的表型即可推知質(zhì)粒是否攜帶外源DNA片段。例如pUC18質(zhì)粒(圖9-3)就具有以下特點(diǎn):①分子量小(2.69kb),也可以接受較大的外源片段。②拷貝數(shù)多,在每個(gè)宿主細(xì)胞的拷貝數(shù)可達(dá)500個(gè);③多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)多,克隆方便;④具有α-互補(bǔ)顯色表型,可作為檢測重組質(zhì)粒存在于否的選擇標(biāo)記。 α-互補(bǔ)是指來自細(xì)菌DNA的lacZ酶(β-半乳糖苷酶)N端的一段氨基酸殘基(α-肽),在與α-肽缺失的酶混合后(體外或體內(nèi)),能恢復(fù)lacZ酶的活性的一種基因內(nèi)互補(bǔ)現(xiàn)象。pUC系列的載體就是利用這一特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。如圖9-3所示, pUC18質(zhì)粒帶有細(xì)菌DNA lacZ基因啟動(dòng)子,操縱子,調(diào)節(jié)基因以及l(fā)acZ 基因α-肽(N端的146個(gè)氨基酸),在lacZ 基因內(nèi)插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn),這段序列與lacZ在同一個(gè)閱讀框架內(nèi)。 pUC18表達(dá)的α-肽具有多克隆位點(diǎn)的18個(gè)氨基酸殘基,仍具有α-互補(bǔ)功能。因此,將pUC18質(zhì)粒轉(zhuǎn)入帶有l(wèi)acZ 基因α-肽缺失的宿主細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)后,在含有5-溴-4-錄-3-吲哚-β-半乳糖苷(5-bromo-4-chhloro-3-indoly-β-galactopyranoside,)及IPTG的培養(yǎng)基上,質(zhì)粒產(chǎn)生N端的146個(gè)氨基酸,宿主菌產(chǎn)生C端的氨基酸,經(jīng)α-互補(bǔ)可產(chǎn)生有功能的lacZ酶,水解X-gal產(chǎn)生一種蘭色物質(zhì),附著于細(xì)菌細(xì)胞上使菌落呈蘭色。當(dāng)在多克隆位點(diǎn)插入一個(gè)外源DNA片段時(shí),破壞了α-肽的閱讀框架,或?qū)朕D(zhuǎn)錄或翻譯終止信號(hào),使α-肽不能正確表達(dá),僅宿主細(xì)菌產(chǎn)生的C端氨基酸沒lacZ 基因有l(wèi)acZ 酶活性,結(jié)果在上述同樣培養(yǎng)條件下,形成的菌落呈白色。所以白色菌落即是帶有外源DNA片段的陽性克隆。
㈡λ噬菌體
    λ噬菌體基因組全長49kb,其核酸序列及基因功能和表達(dá)調(diào)控已研究的十分清楚。 λ噬菌體的DNA中間約2/3的序列位中間基因 (central gene cluster),位于兩端的位DNA 左臂和右臂。研究表明, λ基因組的中間基因序列可被外源DNA 片段取代,而不影響噬菌體感染細(xì)菌及形成噬菌斑的能力。根據(jù)這一特點(diǎn),在改造利用λ噬菌體做載體時(shí),在兩個(gè)臂于中間基因鏈接導(dǎo)入處導(dǎo)入限制性酶切點(diǎn)(如EcoR Ⅰ),酶切λDNA后分別得到兩個(gè)臂(lambda arms),再將經(jīng)同一種酶酶切的外源DNA片段與兩個(gè)臂鏈接構(gòu)成重組DNA分子(圖9-4)。形成的重組DNA分子用噬菌體蛋白包裝提取物體外包裝(in vitro packaging)后,經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)感染具有適宜基因型的宿主細(xì)菌菌株,噬菌體再在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)繁殖,擴(kuò)增,在平板培養(yǎng)基上形成噬菌斑。然后據(jù)噬菌斑的形態(tài)或顯色表型(α-互補(bǔ),如M13系列載體),即可鑒定出陽性克隆。
    λ噬菌體載體可接受15~30kb的外源DNA片段,他既可作為克隆載體,也可作為表達(dá)載體,用作cDNA(如λgt10,λZAPⅡ0或核DNA(如EMBL3,GEM12)克隆的載體。在基因庫篩選中, λ噬菌體作載體與細(xì)菌質(zhì)粒相比,具有易操作,陽性克隆數(shù)多等特點(diǎn),現(xiàn)廣泛用于各類基因庫的構(gòu)建。
㈢柯斯質(zhì)粒
    柯斯質(zhì)粒(cosmid)是利用部分λ噬菌體DNA與部分細(xì)菌質(zhì)粒DNA序列組建而成的(圖9-5)?？滤官|(zhì)粒具有λ噬菌體的cos序列(12bp)細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)。cos序列是噬菌體DNA包裝成噬菌體時(shí)所必需的,而質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)可使柯斯質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞中同普通細(xì)菌質(zhì)粒一樣自主復(fù)制?？滤官|(zhì)粒也具有抗生素抗性基因。
    盡管這種質(zhì)粒的分子量較小,但他可接受長達(dá)50kb的外源DNA片段,這在克隆真核生物基因中十分有用,因?yàn)橐粋€(gè)DNA 片段就可能具有真核生物基因的編碼序列及其他調(diào)控序列?？滤官|(zhì)粒不僅直接用于真核生物基因的分離與克隆(見下面YAC載體)系統(tǒng)結(jié)合,用于基因作圖分析。
㈣穿梭載體
    穿梭載體(shuttle vector)是指能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。例如既能在原核生物中復(fù)制,又能在真核生物中復(fù)制的載體。因此,這類載體不僅具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)及選擇標(biāo)記基因,還有真核生物的自主復(fù)制序列(ARS)以及選擇標(biāo)記性狀,具有多克隆位點(diǎn)。通常穿梭載體在細(xì)菌中用于克隆,擴(kuò)增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表達(dá)分析。
    酵母菌的Yep系列載體(圖9-6)以及Yip。Ycp和Yrp系列載體均是穿梭載體。Yep為酵母菌附加體質(zhì)粒,他的ARS序列來自酵母菌內(nèi)源附加體2μ,可使每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)保持在100個(gè)左右。Yep還具有2μ的兩個(gè)順式調(diào)空元件,質(zhì)粒分配序列和2μ調(diào)空元件。這兩個(gè)元件可使在細(xì)胞分裂中各細(xì)胞分配的質(zhì)粒數(shù)相近, 2μ序列不斷擴(kuò)增。Yep的Amp和四環(huán)素(Tc)抗性用于細(xì)菌中選擇,而URA3(尿嘧啶)基因用于在酵母菌中選擇。Yep24具有Amp及Tc兩個(gè)抗生素抗性基因,可將外源DNA片段插在抗生素基因中,通過插入失活,選擇陽性克隆。尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株URA3-不能合成尿嘧啶,在不含附加尿嘧啶的培養(yǎng)基中不能生長。將帶有URA3基因的Yep轉(zhuǎn)化為URA3-酵母菌菌株后,陽性克隆可在不含附加尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長,而非陽性克隆則不能生長。很多酵母菌的穿梭載體,用于功能互補(bǔ)法分離和鑒定真核生物基因的研究。
㈤細(xì)菌人工染色體
    在進(jìn)行真核生物基因組的分析及作圖中,發(fā)現(xiàn)上述的集中載體都不能攜帶大于50kb以上.細(xì)菌人工染色體(BAC)載體就是為了克隆大的外源DNA片段而設(shè)計(jì)構(gòu)建的。
BAC載體是基于細(xì)菌的性因子(F因子)質(zhì)粒的一些特點(diǎn)構(gòu)建的。如第6章所述,F因子是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)能自我復(fù)制的質(zhì)粒,約100kb,同時(shí)能在細(xì)菌接合時(shí)專一1000kb 的細(xì)菌染色體片段。將F因子經(jīng)基因工程改良構(gòu)成的BAC載體,可用于克隆100kb以上的DNA片段。帶有外源片段的BAC載體在細(xì)菌細(xì)胞中通常僅單個(gè)拷貝,這一特點(diǎn)有利于保持DNA大分子,尤其是重復(fù)序列多的大分子,在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制而不發(fā)生重組。BAC載體本身分子量小,如由小F質(zhì)粒構(gòu)建的載體pBeloBAC11全長7.4kb(圖9-7),僅帶有自我復(fù)制，控制拷貝數(shù)(repE)及質(zhì)粒(parE,parA,parB)所必須的最少序列。這些基因均來自F因子。BAC載體還具有氯霉素抗性選擇基因以及多克隆位點(diǎn)。在pBeloBAC11中,多克隆位點(diǎn)lacZ基因內(nèi),因此可采用選擇pUC18陽性重組子的方法,即α-互補(bǔ)顯色法選擇陽性BAC重組子。此外,在多克隆位點(diǎn)兩側(cè),還有T7及SP6啟動(dòng)子位點(diǎn),用于制備RNA分子,進(jìn)一步分析克隆的基因表達(dá),作為染色體步行的探針,以及序列測定克隆的片段。
㈥酵母人工染色體
    酵母人工染色體(YAC)是與前述的穿梭載體不同的另一類酵母菌穿梭載體。他是人類在對(duì)酵母菌生物學(xué),遺傳學(xué)的基本特征深入研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合穿梭質(zhì)粒Yep的一些特點(diǎn)構(gòu)建而成。YAC也是為適應(yīng)真核生物基因組分析而發(fā)展起來的。1996年酵母菌基因組全部序列已經(jīng)測定,為分析YAC克隆提供了直接依據(jù)。將來自YAC克隆的序列與酵母菌基因組序列比較,即可以完全排除重組YAC載體來自酵母菌DNA的可能性。
    同YAC載體一樣，YAC也具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。此外，YAC還具有酵母菌染色體的一些特點(diǎn)。YAC可以接受100~1000kb 的外源DNA片段，這一特點(diǎn)使YAC成為人類基因組計(jì)劃及圖位克隆分離基因的重要工具，并促進(jìn)了發(fā)展人類人工染色體（human artificial chromosome，HAC） 的研究。
目前應(yīng)用最多的YAC載體是PYAC4(圖9·8)，這個(gè)載體具有以下主要結(jié)構(gòu):①兩個(gè)可在酵母菌中利用的選擇基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因);②酵母菌著絲粒序列 (centromere4,CEN4);③一個(gè)自主復(fù)制序列(ARS1); ④兩個(gè)來自嗜熱四膜蟲 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重復(fù)序列 (TEL),以保持重組YAC為線狀結(jié)構(gòu);⑤在兩個(gè)末端序列中間，有一段填充序列(stuff, HIS3)，以便PYAC4在細(xì)菌細(xì)胞中穩(wěn)定擴(kuò)增;⑥Amp抗性及細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn);⑦一個(gè)EcoR Ⅰ克隆位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于酵母菌Sup4 tRNA基因內(nèi)。Sup4 基因編碼赭色抑制tRNATYR，抑制赭色表型 (成為白色)。如果用不含外源DNA片段的PYAC4載體轉(zhuǎn)化酵母菌，轉(zhuǎn)化子的菌落呈白色。而帶有插入的外源DNA片段的PYAC4重組載體，其Sup4已經(jīng)失活，結(jié)果轉(zhuǎn)化酵母菌后所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子形成赭色菌落。這種插入失活選擇標(biāo)記的應(yīng)用，大大簡化了陽性克隆工作。
在利用PYAC4載體克隆時(shí)，要將PYAC4載體線性化，分離純化帶有染色體末端序列的兩個(gè)臂，同時(shí)分離純化大分子DNA片段，連接后用于轉(zhuǎn)化酵母菌感受態(tài)細(xì)胞。
[七]Ti質(zhì)粒及其衍生載體應(yīng)用基因工程技術(shù)改良植物性狀時(shí)，需要適合于植物系統(tǒng)，才能將重組DNA運(yùn)載到植物細(xì)胞并使目的基因表達(dá)。由Ti質(zhì)粒衍生的載體，是最早成功地把外源基因?qū)胫参锛?xì)胞的植物表達(dá)載體。
    Ti質(zhì)粒是一種細(xì)菌質(zhì)粒 (圖9-9)，它自然存在于一種革蘭氏陰菌——根瘤土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）細(xì)胞中。根瘤土壤桿菌可感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，使之產(chǎn)生冠癭瘤。植物產(chǎn)生的這種根瘤細(xì)胞與動(dòng)物的癌細(xì)胞 (tumor)相似，它們能獨(dú)立地、不受控制地生長。根瘤細(xì)胞的形成是因?yàn)楦鐾寥罈U菌中存在著一種誘導(dǎo)瘤細(xì)胞 (tumor-inducing，Ti)的質(zhì)粒，這種質(zhì)粒被稱為Ti質(zhì)粒。Ti質(zhì)粒的一部分DNA叫做轉(zhuǎn)移DNA（transferDNA，T-DNA）， DNA整合到宿主植物細(xì)胞的染色體后，就誘導(dǎo)出根瘤，并使根瘤細(xì)胞合成冠癭堿 (opine)，作為根瘤土壤桿菌的碳源和氮源。
   1．Ti質(zhì)粒的特點(diǎn)利用缺失、突變、轉(zhuǎn)座及互補(bǔ)等方法對(duì)Ti質(zhì)粒的研究，發(fā)現(xiàn)Ti質(zhì)粒具有以下特點(diǎn):
(1) Ti質(zhì)粒具有5個(gè)主要功能區(qū)域 (圖9-9)。它們分別是T-DNA、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移 (plasmid transfer)、冠癭堿代謝 (opine catabolism)、復(fù)制原點(diǎn) (oir)和毒性區(qū)域 (vir)。
(2)T-DNA中直接參與轉(zhuǎn)移并整合到植物染色體上的序列，僅是T-DNA兩端與其他序列交界處的25bp不完全直接重復(fù) (imperfect direct repeat)，右端的這段序列稱為右界 （right border，RB），左端的序列稱為左界 (left border，LB )。T-DNA內(nèi)的致瘤細(xì)胞誘導(dǎo)根瘤細(xì)胞，由這類細(xì)胞不能再生成植株。T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無關(guān)，所以將致瘤基因全部缺失即卸甲（disam）后，將細(xì)菌抗生素的抗性基因或其他序列插入到這個(gè)區(qū)域，形成的T-DNA仍可將RB至LB內(nèi)的序列轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組。
(3)vir的毒性基因是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的，毒性基因可以順式及反式兩種方式控制T-DNA轉(zhuǎn)移。
Ti質(zhì)粒是約200~500kb的環(huán)狀DNA分子，很難用作DNA克隆載體進(jìn)行操作。
2. Ti質(zhì)粒的衍生載體根據(jù)Ti質(zhì)粒的特點(diǎn)，現(xiàn)已構(gòu)建成以下兩套質(zhì)粒衍生的載體系統(tǒng)，廣泛用作植物基因工程中的載體。
(1)雙元載體 （binary vector）。這個(gè)系統(tǒng)具有兩個(gè)質(zhì)粒，一個(gè)是用于克隆外源基因片段的克隆質(zhì)粒，可在大腸桿菌及根瘤土壤桿菌中復(fù)制，容易操作，并可在二者間轉(zhuǎn)移，也是一種穿梭質(zhì)粒。在T-DNA序列外，還有細(xì)菌選擇標(biāo)記基因，在T-DNA的LB至RB內(nèi)有一個(gè)多克隆位點(diǎn)及植物選擇標(biāo)記基因。如Pbin 19載體，它具有原核生物的卡那霉素抗性基因 (AphI)作為細(xì)菌選擇標(biāo)記，真核生物的卡那霉素抗性基因（nos-NptⅡ）作為植物的選擇標(biāo)記，pUC19的多克隆位點(diǎn)及a-互補(bǔ)顯色標(biāo)記。雙元載體的另一個(gè)質(zhì)粒，如與Pbin 19匹配使用的Pal404質(zhì)粒是非致病Ti質(zhì)粒，該質(zhì)粒沒有T-DNA序列，具有Ti質(zhì)粒的毒性基因，毒性基因表達(dá)的產(chǎn)物以反式調(diào)控方式控制穿梭質(zhì)粒上T-DNA的轉(zhuǎn)移。將兩個(gè)質(zhì)粒分別導(dǎo)人根瘤土壤桿菌后，經(jīng)根瘤土壤桿菌介導(dǎo)，克隆質(zhì)粒中的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物基因組中。
(2)共整合載體 (integrated vector)。這個(gè)系統(tǒng)也包括兩個(gè)質(zhì)粒，一個(gè)用作克隆外源基因的質(zhì)粒 (如Pmon200)，另一個(gè)帶有毒性基因 (如Ptib6S3-SE)。與雙元載體的主要區(qū)別是這兩個(gè)質(zhì)粒具有一段同源序列，它們?cè)诟鐾寥罈U菌中經(jīng)過重組整合成一個(gè)載體，故稱共整合載體。
還有另一類用于植物基因工程的載體，不經(jīng)根瘤土壤桿菌介導(dǎo)而是在其他物理及化學(xué)方法的作用下，將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，并整合到植物基因組中。這種載體與乃衍生質(zhì)粒不同，與酵母菌穿梭質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)類似。它們通常也具有氨卞青霉素抗性基因，用作細(xì)菌選擇標(biāo)記;具有潮霉素或除草劑抗性基因用作植物選擇標(biāo)記。這類載體如Pahc25主要用于將外源基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞