免疫酶組化技術(shù)是用酶標(biāo)記抗體通過顯色反應(yīng)檢測細(xì)胞和組織內(nèi)的抗原，從而達(dá)到診斷和研究疫病的目的?？乖臏?zhǔn)確顯示和定位與制備的細(xì)胞和組織標(biāo)本質(zhì)量的好壞有著密切的聯(lián)系。由于各種抗原的生化、物理性質(zhì)不同，免疫學(xué)活性可受到溫度高低、酸堿度強(qiáng)弱及各種化學(xué)試劑作用的影響，良好的細(xì)胞和組織學(xué)結(jié)構(gòu)將有助于抗原的準(zhǔn)確定位。因此，細(xì)胞和組織標(biāo)本的采集、制備在免疫組化技術(shù)中占有十分重要的位置。
（一）細(xì)胞標(biāo)本的取材
1.印片法 主要應(yīng)用于活組織檢查標(biāo)本和剖檢取材標(biāo)本。新鮮標(biāo)本做剖面，充分暴露病變區(qū)，將載玻片輕輕壓于病變區(qū)，脫落的細(xì)胞便粘附在玻片上，立即浸入細(xì)胞固定液內(nèi) 5~10min ，取出后自然干燥，低溫保存?zhèn)溆谩?br>    其優(yōu)點(diǎn)是簡便省時(shí)，細(xì)胞抗原保存較好；缺點(diǎn)是細(xì)胞分布不均勻，玻片上細(xì)胞重疊，影響標(biāo)記效果。
2.涂片法 將培養(yǎng)細(xì)胞制成 2 × 10⁶ 個(gè)細(xì)胞 /mL 的細(xì)胞懸液，用細(xì)胞離心涂片器或注射針頭式滴管涂布于載玻片上，自然干燥，固定液固定，低溫保存?zhèn)溆谩?br>    對有貼壁生長特性的細(xì)胞可將蓋玻片直接置于培養(yǎng)液內(nèi)，即可得到理想的細(xì)胞標(biāo)本，取出后 PBS 清洗、固定、 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?span lang=EN-US>
    如待檢物為組織液、分泌物、血液等，可在載玻片上做涂片，固定后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?span lang=EN-US>
（二）組織標(biāo)本的取材
    為避免組織自溶造成的抗原性消失、彌散現(xiàn)象，應(yīng)盡快固定處理。取材時(shí)要注意：
1.取材部位應(yīng)是主要病變區(qū)；
2.必須取病灶與正常組織交界區(qū)；
3.必要時(shí)取遠(yuǎn)離病灶區(qū)的正常組織做對照。
（三）細(xì)胞和組織的固定
1 、 固定
    為了更好的保持細(xì)胞和組織原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止組織自溶，有必要對細(xì)胞和組織進(jìn)行固定。固定的作用不僅是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止或抑制外源性和內(nèi)源性酶活性，更重要的是最大限度的保存細(xì)胞和組織的抗原性，使水溶性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榉撬苄钥乖?，防止抗原彌散?br>2 、 固定劑
    用于免疫組化的固定劑種類較多，性能各異，在固定半穩(wěn)定性抗原時(shí)，尤其要重視固定劑的選擇。
醛類固定劑 雙功能交聯(lián)劑，其作用是使組織之間相互交聯(lián)，保存抗原于原位，其特點(diǎn)是對組織穿透性強(qiáng)，收縮性小。對 IgM 、 IgA 、 J 鏈、 k 鏈和 λ 鏈的標(biāo)記效果良好，背景清晰，是常用的固定劑。
（ 1 ） 10% 中性緩沖福爾馬林（甲醛原液 10mL ， 0.01moL/L pH7.4 PBS 90mL ）。
（ 2 ） 10% 鈣 - 福爾馬林（甲醛原液 10mL ，飽合碳酸鈣 90mL ）。
（ 3 ） 10% 多聚甲醛磷酸緩沖液（多聚甲醛 40g ， 0.1moL/L pH7.4 PBS 500mL ，兩者混合加熱至 60 ℃ ，攪拌并滴加 1N NaOH 至清晰為止，冷卻后加 PBS 液至總量 1000mL 。
丙酮及醇類固定劑 是最早使用的免疫組化染色的固定劑，其作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖，對組織穿透性強(qiáng)，保存抗原的免疫活性較好，但醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)的保存效果較差，解決的辦法是和其它試劑混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
（ 1 ）丙酮的組織穿透性和脫水性更強(qiáng)，常用于冰凍切片及細(xì)胞涂片的后固定，保存抗原較好，平時(shí) 4 ℃ 低溫保存?zhèn)溆?，臨用時(shí)，只需將涂片插入冷丙酮內(nèi) 5~10min ，取出后自然干燥，低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br>（ 2 ） Clarke 改良固定劑（ 100% 乙醇 95mL ，冰醋酸 mL ），用于冰凍切片的后固定。
（ 3 ）乙醚（或氯仿）與乙醇等量混合液。對組織穿透性極強(qiáng)，即使涂片上含較多的粘液，固定效果仍較好，是理想的細(xì)胞固定液。
（ 4 ） AAF 液（ 95%~100% 乙醇 85mL 冰醋酸 5mL ，濃甲醛 10mL ）。
用于免疫組化的固定劑種類很多，不同的抗原和標(biāo)本需經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，選用最佳固定液。迄今為止，尚無一種標(biāo)準(zhǔn)固定液可用于各種不同的抗原固定，選擇最佳固定液的標(biāo)準(zhǔn)是：
① 能最好地保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)；
② 最大限度地保存抗原的免疫活性。
一些含重金屬的固定液在免疫組化技術(shù)中是禁用的。實(shí)際工作中，中性福爾馬林（或多聚甲醛）是適應(yīng)性較廣泛的固定液，但固定時(shí)間不宜過長。必要時(shí)，可作多種固定液對比，從中選出理想的固定液。
3 、 組織固定時(shí)應(yīng)注意：
（ 1 ）應(yīng)盡快固定處理要取材的組織，力求保持組織新鮮，不干燥。
（ 2 ）組織塊不要過大過厚，尤其厚度不要超過 1cm 。
（ 3 ）固定液量要充足，一般要 20 倍于組織的量，量太少會(huì)造成固定液濃度降低。
（ 4 ）組織固定后應(yīng)充分水洗，去除固定液，以減少固定液造成的人為假象。固定時(shí)間最好以完全浸透為宜（ 12h~72h ），固定時(shí)間過久可能會(huì)影響染色效果。
（四）組織的脫水、透明、浸蠟
    做石蠟切片的組織需經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋，才能制備出薄片。整個(gè)操作過程中要掌握的原則是：脫水透明要夠而不過，浸蠟的溫度不宜超過 64 ℃ ，否則一是可能使抗原活性下降，降低檢出率，另外還可能造成組織焦脆，焦脆的組織切片困難，即使勉強(qiáng)切下來了，染色過程中也極易脫片，且染色效果不好。具體程序如下：

組織脫水、透明、浸蠟程序

從蠟缸拿出后用石蠟進(jìn)行包埋。

（五）切片
1.載玻片的預(yù)處理     載玻片的處理是做好免疫組化染色的重要步驟，尤其對一些需做酶消化、微波或高壓處理、 PCR 擴(kuò)增的組織切片更為重要，目前常用的防脫片劑有以下幾種：
（ 1 ） APES （ 3- 氨丙基三乙氧硅烷） 它可以和組織、玻片上的氫鍵形成共價(jià)鍵。用甲醇 / 丙酮配成 2% 濃度使用。 APES 使用方便，便于大量應(yīng)用，且價(jià)格便宜。
（ 2 ） 1% 鉻明礬明膠
（ 3 ）白膠
（ 4 ）多聚左旋賴氨酸 粘貼較緊，可用于多種組織化學(xué)、原位核酸分子雜交等。但其價(jià)格較貴。
2.切片
    用石蠟切片機(jī)將包埋有組織的蠟塊切成薄片，切片厚度一般 3—5μm ，除腦組織等細(xì)胞量較少的組織外，切片要盡可能薄， 45 ℃ 水溫展片，要盡量展平，否則皺褶處易出現(xiàn)非特異染色。 55~60 ℃ 溫箱烤片 2 小時(shí)，防水密封，低溫保存?zhèn)溆谩?/span>