培養(yǎng)基是將微 生物生長(zhǎng)繁殖所需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的各種營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基為微生物的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生存空間。它具有微生物正常生活所需的各種養(yǎng)料和適宜的環(huán)境條件；（1）適當(dāng)組分和比例的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；（2）適宜的pH值；（3）合適的滲透壓；（4）保持無(wú)菌狀態(tài)。所以培養(yǎng)基是培養(yǎng)微生物所必需的最主要材料。培養(yǎng)基的配制是微生物學(xué)工作者的主要技術(shù)操作之一。

培養(yǎng)基的種類：

根據(jù)培養(yǎng)基的組成成分，可將培養(yǎng)基分為三類：

合成培養(yǎng)基：由各種純化學(xué)物質(zhì)按一定比例配制而成。

半合成培養(yǎng)基：由一部分純化學(xué)物質(zhì)和另一部分天然物質(zhì)配制而成。

天然培養(yǎng)基：利用天然來(lái)源的有機(jī)物配制而成的。

從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來(lái)分：

液體培養(yǎng)基：不加凝固劑的液態(tài)狀培養(yǎng)基。

固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入2％左右的凝固劑的固體狀培養(yǎng)基或固體狀農(nóng)副產(chǎn)品培養(yǎng)基。

半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.2％-0.5％凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。

微生物最常用的凝固劑為瓊脂（其次為明膠），又叫洋菜、凍粉。它不是一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，只能被極少數(shù)種類的細(xì)菌分解利用。瓊脂是從海藻中（主要是石花菜）提取而制成的。是一種多糖類化合物，主要成分是復(fù)雜的多糖硫酸酯鈣鹽，瓊脂是一種可逆性膠體，在常規(guī)濃度下加熱到96C以上即成溶膠狀態(tài)，融化的瓊脂，當(dāng)溫度下降到42℃以下，又凝固為固體。

l. 了解培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制過(guò)程。

2. 了解幾種滅菌方法，掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。

3. 熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關(guān)準(zhǔn)備工作及操作方法。

1. 藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、馬鈴薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O等。

2. 高壓蒸汽滅菌器、恒溫干熱滅菌箱、細(xì)菌過(guò)濾器、紫外線殺菌燈。

3. 其它：天平、牛角匙、電爐、1N HCl、1N NaOH、pH試紙、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、帶玻璃珠的三角瓶、帶棉塞的無(wú)菌試管、無(wú)棉塞的空試管、培養(yǎng)血、吸管、各種包裝紙防水紙、繩索、棉花、標(biāo)簽等。

（一）、培養(yǎng)基配制

l. 培養(yǎng)基配制的一般方法和步驟

（1）稱量：按照培養(yǎng)基配方，正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。

（2）溶化：在搪瓷杯中加入所需水量（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入蒸餾水或自來(lái)水），用玻棒攪勻，加熱溶解。

（3）調(diào)pH值（調(diào)pH也可以在加瓊脂后再調(diào)），用1N NaOH或1N HCl調(diào)pH，用pH試紙對(duì)照。

表 6-1 瓊脂和明膠的特性比較

（4）加瓊脂溶化，在瓊脂溶化過(guò)程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦，待完全溶化后，補(bǔ)足所失水分，一般數(shù)量少，時(shí)間短不必補(bǔ)水。

（5）分裝：在漏斗架上分裝。根據(jù)不同的需要進(jìn)行分裝，一般制斜面的裝置為管高的1／5 特別注意不要使培養(yǎng)基粘污在管（瓶）口上以免浸濕棉塞，引起污染。

（6）包扎成捆、掛上標(biāo)簽。培養(yǎng)基分裝好后，塞上棉塞，用防水紙包扎成捆掛上所配培養(yǎng)基名稱的標(biāo)簽。

（7）滅菌備用。滅菌后如需制成斜面的，應(yīng)在下磅后取出，擺成斜面（見(jiàn)圖6-1）。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h，如確無(wú)菌生長(zhǎng)、方可使用。

圖6-1 滅菌的試管培養(yǎng)基趁熱擺成斜面

2．三種培養(yǎng)基的配方及具體配制方法

（1）. 牛肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基（用于分離和培養(yǎng)細(xì)菌，是一種天然培養(yǎng)基）。

配方：

本實(shí)驗(yàn)將原配方配成各種濃縮液。各種濃度如下：30％牛肉膏、50％蛋白胨、30％氯化鈉。以配制200mL培養(yǎng)基為例。

吸取30％牛肉膏2mL；50％蛋白胨2mL；30％氯化鈉2mL；加入有刻度的搪瓷燒杯中，然后用自來(lái)水補(bǔ)足到200mL。用玻棒攪勻，在電爐上稍加熱，調(diào) pH至 7.4，加瓊脂4g，加熱熔化，用玻棒不斷攪拌，至瓊脂完全溶解為止，趁熱在漏斗架上裝試管，（見(jiàn)圖6－2）。裝帶有棉塞的無(wú)菌試管，裝置1／5的試管高度共12支，作斜面培養(yǎng)基、用鋁殼試管帽的里裝10mL。約試管高度的 1／2以上，用作分離時(shí)倒平板用。

圖 6-2 分裝培養(yǎng)基圖 6-3 將培養(yǎng)基試管包扎成捆

分裝完畢，以12支為一捆，用防水紙包扎成捆（圖6-3），掛上標(biāo)簽，滅菌備用。

（2）. 馬鈴薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）瓊脂培養(yǎng)基（用于分離和培養(yǎng)真菌之用，是一種半合成培養(yǎng)基）。

配方：

制備方法配制200mL培養(yǎng)基為例

取上皮馬鈴薯40g，切成小塊、放入無(wú)刻度的搪瓷杯中，加水200mL，置電爐上加熱煮沸10min，用4層紗布過(guò)濾至具刻度的搪瓷杯中，濾液加水補(bǔ)足至200mL。然后加蔗糖4g，加瓊脂4g，加熱熔化并用玻棒不斷攪拌直至瓊脂完全溶化分裝試管，下面一系例步驟同配細(xì)菌培養(yǎng)基相同。

（3）. 淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏一號(hào)Gause’I），用干分離和培養(yǎng)放線菌，是一種合成培養(yǎng)基。

配方：

制備方法配制（以配制200mL）培養(yǎng)基為例：

吸取配方液：1％KNO320mL；1％K2 HPO410mL；1％MgSO4·7H2 O10mL；l％NaCl10mL；1％FeSO4 7H2O0.02mL．加水補(bǔ)足至 200mL，置電爐上加熱.用另一只搪瓷杯稱取可溶性淀粉4g，從200mL中取出少量加入淀粉中，用玻棒調(diào)成糊狀，待液體沸騰后將淀粉糊洗入培養(yǎng)液中，攪勻，調(diào)pH至 7.4，加瓊脂 4g，加熱至瓊脂完全溶化為止，趁熱分裝試管，以下一系例步驟同于配制細(xì)菌培養(yǎng)基的操作方法。

3. 無(wú)菌水的制備

無(wú)菌水，為下一次微生物分離實(shí)驗(yàn)中所需用而準(zhǔn)備。

100mL三角瓶（裝有玻璃珠），裝自來(lái)水45mL，試管中裝9mL自來(lái)水，塞上棉塞，包扎滅菌備用。三角瓶和試管須預(yù)先塞好棉塞，并經(jīng)干熱滅菌。

（二）分離培養(yǎng)微生物常用器皿的準(zhǔn)備

1. 清洗一些玻璃儀器：如三角瓶試管，培養(yǎng)皿、吸管等。

2. 棉塞的制作：裝培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞梯塞的作用為過(guò)濾空氣，使試管內(nèi)外空氣可以流通，但外界空氣中雜菌不能進(jìn)入，避免污染、試管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口約1-2mm處，用解剖針塞入少許棉花，（約1-1.5cm 長(zhǎng)）以防止細(xì)菌吸入口中，井避免將口中細(xì)菌吹入管內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜。吹時(shí)以能通氣但不使棉花塞下滑為準(zhǔn)。

教師示范做試管棉塞，同學(xué)每人做5支試管棉塞。棉塞要求不緊不松，兩頭光滑。試管棉塞的長(zhǎng)度約3cm左右。塞入試管內(nèi)部分約占2/3，頭部稍大約占1/3左右，見(jiàn)圖6-4。

圖6-4 試管棉塞的規(guī)范要求

1. 正確式樣2. 管內(nèi)部分太短，管外部分太松3. 外部過(guò)小

4. 整個(gè)棉塞太松5. 管內(nèi)部分過(guò)緊，外部太松

3. 包裝培養(yǎng)皿和吸管等。為了使培養(yǎng)皿、吸管、三角玻棒等洗凈，干熱滅菌后，不讓表面暴露，以保證無(wú)菌狀態(tài)，為此干熱滅菌前先用舊報(bào)紙包裝妥當(dāng)（見(jiàn)示范），每組同學(xué)包培養(yǎng)皿6只（一包）。

吸管的包裝，將塞好棉花的吸管尖端，放在4~5cm寬的長(zhǎng)紙條的一端，約成45°角左右，折疊紙條，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來(lái)。上端剩余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌，見(jiàn)圖6-5。

圖6－5吸管滅菌前用紙包卷示意圖

（三）培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法

滅菌的方法，通常可以分為四大類：（1）加熱滅菌：包括直接灼燒滅菌、干熱滅菌、加壓蒸汽滅菌、間歇滅菌和煮沸消毒；（2）過(guò)濾去菌；（3）射線滅菌和消毒；（4）化學(xué)藥劑滅菌和消毒。

在本實(shí)驗(yàn)中，介紹與培養(yǎng)基和玻璃器材滅菌有關(guān)的部份滅菌方法。

l. 干熱滅菌法（即熱空氣滅菌法）

干熱滅菌一般是利用電熱烘箱作為干熱滅菌器。前面所包裝好的玻璃器皿，如帶棉塞的三角瓶，試管、包裝好的吸管、培養(yǎng)皿等，放入電熱烘箱中。

打開(kāi)烘箱頂部的通氣孔，接上電源加熱，使箱內(nèi)空氣的溫度達(dá)到160℃~170℃，關(guān)閉通氣孔使箱內(nèi)的溫度保持在160℃左右并維持1.5-2h。時(shí)間一到，切斷電源。待溫度下降60℃~70℃以下，方可打開(kāi)箱門取滅菌物品，否則驟冷后易使箱內(nèi)玻璃儀器破損。

2. 加壓蒸氣滅菌法

利用高壓滅菌器，使水的沸點(diǎn)在密閉的滅菌器內(nèi)隨壓力升高而增高（見(jiàn)表6-2），來(lái)提高蒸汽的溫度和滅菌的效率。

在同一溫度下濕熱的殺菌效率比干熱大，因?yàn)槲⑸锛?xì)胞蛋白質(zhì)在濕熱情況下，易干凝固（見(jiàn)表6-3）。同時(shí)濕熱的穿透力強(qiáng)，當(dāng)水蒸汽與被滅菌的物品相接觸后，便放出汽化潛熱，逐步提高被滅菌物品的溫度，直至與水蒸汽的溫度相等，達(dá)到平衡為止，從而提高滅菌效率。

表6－2 滅菌器內(nèi)空氣比例與溫度之間的關(guān)系

表6－3 蛋白質(zhì)含水量與凝固溫度之間的關(guān)系

手提式高壓滅菌鍋滅菌的操作步驟如下：

（1）在滅菌器內(nèi)加入一定量的水（有的滅菌器內(nèi)加水至止水線）。將用防水紙包扎好的滅菌物品如培養(yǎng)基、無(wú)菌水等，放進(jìn)滅菌器內(nèi)。

（2）接通電源，進(jìn)行加熱。

（3）當(dāng)壓力到達(dá)5bl/in2時(shí)，打開(kāi)放氣閥，使鍋內(nèi)的空氣和水蒸汽一同排出，直至壓力表的壓力恢復(fù)到零，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱。

（4）當(dāng)壓力表＊的壓力到達(dá)15bl/in2（即 1.05kg/cm2）時(shí)，此時(shí)滅菌器內(nèi)的溫度達(dá)到121℃，維持30min不變。對(duì)熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基滅菌時(shí)，應(yīng)適當(dāng)降低壓力，延長(zhǎng)時(shí)間。

（5）滅菌時(shí)間一到，切斷電源，待壓力下降至零時(shí)，才能打開(kāi)排氣孔，然后打開(kāi)滅菌器蓋，取出物品。如果滅菌后的固體培養(yǎng)基要做成斜面，需趁熱放置。還需檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底。

3. 間歇滅菌法

常采用阿諾（Arnold）氏滅菌器和柯赫（Koch）氏滅菌器或蒸籠滅菌，常壓條件下蒸汽溫度不超過(guò)100℃。在沒(méi)有高壓滅菌器設(shè)備的情況下或不宜加壓滅菌的物品，可采用此法滅菌。

方法是：待滅菌物品放在滅菌器或蒸籠里，每d蒸煮1次，每次煮沸l(wèi)h，連續(xù)3d重復(fù)進(jìn)行。在每?jī)纱握糁笾g，將物品（指培養(yǎng)基）放在37C恒溫條件下培養(yǎng)過(guò)夜，這樣可以使每次蒸煮后未殺死的殘留芽孢萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體，以便下1次蒸煮時(shí)殺滅。

4. 過(guò)濾除菌法

一些不能加熱滅菌的液體物質(zhì)（如維生素、血清），可以用過(guò)濾除菌法，一般用細(xì)菌過(guò)濾器進(jìn)行除菌。（教師示范）

細(xì)菌過(guò)濾器中的過(guò)濾板常用陶瓷、硅藻土或石棉等做成，過(guò)濾板孔眼很小，細(xì)菌不能通過(guò)。因此，過(guò)濾后的液體就除去了細(xì)菌。在進(jìn)行過(guò)濾除菌前，整個(gè)細(xì)菌過(guò)濾器和接受液體的器皿，必須要包裝妥當(dāng)并進(jìn)行加壓蒸汽滅菌后方可使用。

下面介紹石棉板濾器的構(gòu)造及其操作方法。石棉板濾器又稱蔡氏（Scitz）濾器，它是由石棉制成的圓形濾板和一個(gè)特制漏斗組成（見(jiàn)圖6-6a）。此漏斗分上下兩節(jié)。上節(jié)為圓形金屬筒，下節(jié)為金屬漏斗。兩節(jié)由三個(gè)活動(dòng)螺旋固定，便于裝卸。使用時(shí)拆開(kāi)兩節(jié)，將濾板放在漏斗上的金屬篩板，再加上上節(jié)，然后將螺旋扭緊，將欲濾溶液置于濾器中抽濾。每次過(guò)濾必須用一張無(wú)菌的新濾板。石棉板濾器因容積大小不同而有各種型號(hào)，石棉板也有不同規(guī)格型號(hào)使用時(shí)必須根據(jù)需要搭配妥當(dāng)。圖6-6b為一個(gè)注射器裝備濾器，用于不便高壓蒸汽滅菌的維生素液或其他溶液的除菌和氣體的除菌，極為方便。

圖6－6 過(guò)濾除菌裝置a. 蔡氏過(guò)濾器b. 注射器濾器裝置

5. 紫外線滅菌

波長(zhǎng)260~280nm之間的紫外線有很強(qiáng)的殺菌能力，一般紫外燈管能產(chǎn)生253.7nm的紫外光，殺死力強(qiáng)而穩(wěn)定，但穿透力弱一般只適宜物體表面、空氣滅菌。例如接種室、培養(yǎng)室、手術(shù)室、藥廠包裝室等空氣滅菌。一般30w燈管、9m3空間，距地面2m每次打開(kāi)紫外線照射0.5h，就使室內(nèi)空氣滅菌。若照射紫外線時(shí)，先噴灑石碳酸等化學(xué)消毒劑，可增強(qiáng)滅菌效果。

在進(jìn)行微生物接種和分離等操作時(shí)，常須用紫外線來(lái)殺滅接種室（箱）空氣、臺(tái)面等處的微生物。（參觀示范）

紫外線雖有較強(qiáng)的殺菌力，但穿透力較弱，即使一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除，因此只適用于空氣及表面殺菌。

紫外線對(duì)眼粘膜及視神經(jīng)有強(qiáng)烈的損傷作用，對(duì)皮膚有刺激作用，所以不能直接在紫外線燈開(kāi)啟下工作和用眼睛直視開(kāi)啟的紫外燈。

6. 化學(xué)藥劑消毒滅菌

微生物實(shí)驗(yàn)室中常用的化學(xué)殺菌劑有升汞、甲醛、高錳酸鉀、酒精、碘酒、龍膽紫、石炭酸、漂白粉、新潔爾滅、煤酚皂溶液，它們有的是殺菌劑，有的是抑菌劑，詳見(jiàn)表6-4。

表6－4 各類化學(xué)藥劑消毒滅菌的濃度、作用方式和用法

1、配固體培養(yǎng)基加瓊脂后加熱溶化時(shí)要注意哪些問(wèn)題？

2、培養(yǎng)基中加瓊脂的作用是什么？

3、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和間歇滅菌的場(chǎng)合有何不同？

4、如何檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底？