核酸探針的種類
　　基因探針根據(jù)標記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類，根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類，DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。下面分別介紹這幾種探針。
　?。ㄒ唬〥NA探針
　　
DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針?，F(xiàn)已獲得DNA探針數(shù)量很多，有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞DNA探針。
這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細菌的毒力因子基因探針和人類Alu探針。這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細菌的分類和菌種鑒定比之G+C百分比值要準確的多，是細菌分類學(xué)的一個發(fā)展方向。加之分子雜交技術(shù)的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。細菌的基因組大小約5×106bp，約含3000個基因。各種細菌之間絕大部分DNA是相同的，要獲得某細菌特異的核酸探針，通常要采取建立細菌基因組DNA文庫的辦法，即將細菌DNA切成小片段后分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫。然后用多種其它菌種的DNA作探針來篩選，產(chǎn)生雜交信號的克隆被剔除，最后剩下的不與任何其它細菌雜交的克隆則可能含有該細菌特異性DNA片段。將此重組質(zhì)粒標記后作探針進一步鑒定，亦可經(jīng)DNA序列分析鑒定其基因來源和功能。因此要得到一種特異性DNA探針，常常是比較繁瑣的。探針DNA克隆的篩選也可采用血清學(xué)方法，所不同的是所建DNA文庫為可表達性，克隆菌落或噬斑經(jīng)裂解后釋放出表達抗原，然后用來源細菌的多克隆抗血清篩選陽性克隆，所得到多個陽性克隆再經(jīng)其它細菌的抗血清篩選，最后只與本細菌抗血清反應(yīng)的表達克隆即含有此細菌的特異性基因片段，它所編碼的蛋白是該菌種所特有的。用這種表達文庫篩選得到的顯然只是特定基因探針。
　　對于基因探針的克隆尚有更快捷的途徑。這也是許多重要蛋白質(zhì)的編碼基因的克隆方法。該方法的第一步是分離純化蛋白質(zhì)，然后測定該蛋白的氨基或羥基末端的部分氨基酸序列，然后根據(jù)這一序列合成一套寡核苷酸探針。用此探針在DNA文庫中篩選，陽性克隆即是目標蛋白的編碼基因。值得一提的是真核細胞和原核細胞DNA組織有所不同。真核基因中含有非編碼的內(nèi)含子序列，而原核則沒有。因此，真核基因組DNA探針用于檢測基因表達時雜交效率要明顯低于cDNA探針。
　　DNA探針（包括cDNA探針）的主要優(yōu)點有下面三點：①這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。②DNA探針不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機引物法，PCR標記法等，能用于同位素和非同位素標記。
　　（二）cDNA探針
　　cDNA（complementary DNA）是指互補于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA經(jīng)一種稱為逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的，這種逆錄酶是Temin等在70年代初研究致癌RNA病毒時發(fā)現(xiàn)的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對）。這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱反向轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄。攜帶逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒侵入宿主細胞后，病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA，并進而整合人宿主細胞染色體DNA分子，隨宿主細胞DNA復(fù)制同時復(fù)制。這種整合的病毒基因組稱為原病毒。在靜止狀態(tài)下，可被復(fù)制多代，但不被表達，故無毒性。一旦因某種因素刺激而被活化，則該病毒大量復(fù)制，如其帶有癌基因，還可能誘發(fā)細胞癌變，后來發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶不僅普遍存在于RNA病毒中，而且哺乳動物的胚胎細胞和正在分裂的淋巴細胞也含有逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，RNA為模板，tRNA（主要是色氨酸t(yī)RNA）為引物，在Trna3’-OH末端上，5’－3’方向，合成與RNA互補的DNA單鏈，稱為互補DNA（cDNA），單鏈cDNA與模板RNA形成RNA-DNA雜交體。隨后在逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性作用下，將RNA鏈水解成小片段。cDNA單鏈的3’末端回折形成一個小引物末端，逆轉(zhuǎn)錄酶又以第一條cDNA鏈為模板再合成第二第cDNA鏈，至此，完成逆轉(zhuǎn)錄全過程，合成雙鏈cDNA。
　　逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在已成為一項重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于基因的克隆和表達。從逆轉(zhuǎn)錄病毒中提取的逆轉(zhuǎn)錄酶已商品化，最常用的有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。利用真核Mrna3’末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸（oligo(dT)）用作引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成互補于mRNA的cRNA鏈，然后再用RNase H將mRNA消化掉，再加入大腸桿菌的DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈，即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉(zhuǎn)錄過程。
　　所得到的雙鏈cDNA分子經(jīng)S1核酸酶切平兩端后接一個有限制酶切點的接頭（linker），再經(jīng)特定的限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與含互補末端的載體進行連接。常用的克隆載體是λ噬菌體DNA，如λgt，EMBL和Charon系列等。用這類載體可以得到包含104以上的轉(zhuǎn)化子的文庫，再經(jīng)前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術(shù)獲得的DNA探針不含有內(nèi)含子序列。因此尤其適用于基因表達的檢測。
　?。ㄈ㏑NA探針
　　RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA探針是細胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程中得到標記的，標記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測。例如，在篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒人類免疫缺陷病毒（HIV）的基因組DNA克隆時，因無DNA探針可利用，就利用HIV的全套標記mRNA作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組DNA克隆。又如進行中的轉(zhuǎn)錄分析（nuclear run on transcrip－tion assay）時，在體外將細胞核分離出來，然后在α-32P-ATP的存在下進行轉(zhuǎn)錄，所合成mR－NA均摻入同位素而得到標記，此混合mRNA與固定于硝酸纖維素濾膜上的某一特定的基因的DNA進行雜交，便可反映出該基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，這是一種反向探針實驗技術(shù)。
　　近幾年體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)不斷完善，已相繼建立了單向和雙向體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要基于一類新型載體pSP和pGEM，這類載體在多克隆位點兩側(cè)分別帶有SP6啟動子和T7啟動子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可以進行RNA轉(zhuǎn)錄，如果在多克隆位點接頭中插入了外源DNA片段，則可以此DNA兩條鏈中的一條為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA。這種體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率很高，在1h內(nèi)可合成近10μg的RNA產(chǎn)生，只要在底物中加入適量的放射性或生物素標記的NTP，則所合成的RNA可得到高效標記。該方法能有效地控制探針的長度并可提高標記物的利