蛋白印跡，也稱Western，Western blot、Western blotting、Western印跡，是檢測(cè)蛋白的重要方法之一。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。 

（一） 蛋白樣品的制備

可以選用適當(dāng)?shù)牧呀庖海呀赓N壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提。

為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，收集的蛋白樣品均應(yīng)測(cè)定其蛋白濃度。在微量離心管中，用2×SDS加樣緩沖液按1:1(v/v)稀釋待測(cè)蛋白質(zhì)樣品，于100℃煮沸5-10min。以充分變性蛋白。使用濃縮的蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以加入更多的蛋白樣品。

（二）SDS-PAGE電泳

1. SDS-PAGE凝膠配制

（1）取出玻璃板，用自來(lái)水洗凈后，蒸餾水沖洗一次，置37 度烘干或晾干（戴手套操作），梳子應(yīng)用水洗凈，臨用前用乙醇擦拭，揮發(fā)至干。組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，并固定在灌膠支架上，確保不漏膠。

（2）按表1配制分離膠液體并脫氣，其中AP和TEMED灌膠前再加入，輕輕搖勻，以免產(chǎn)生氣泡。

表1  凝膠的制備

按所需分離的蛋白質(zhì)分子大小配制合適濃度的凝膠（表2），將凝膠溶液平穩(wěn)地注入兩層玻板中（以平穩(wěn)流速?gòu)?/span>墊片的邊緣注入），緩慢持續(xù)注入至液面距梳齒2-3厘米處，再在液面上小心注入一層水飽和異丁醇（厚約1cm），以隔絕空氣，靜置直至凝膠的形成（聚合后，可見(jiàn)在異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線）。

表2  SDS-PAGE凝膠的有效分離范圍

（3）傾去頂層的異丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面,盡量用吸水紙吸干。按表1配制積層膠液體，以連續(xù)平穩(wěn)的流速在分離膠上面注入濃縮膠液至玻板頂端，然后立即小心的插入梳子。必要時(shí)，再補(bǔ)加積層膠液體充盈剩余空間，室溫聚合30min。

2.上樣與電泳

（1）待濃縮膠完全聚合后，取下梳子，用1×SDS電泳緩沖液洗滌加樣槽，以除去未聚合的丙烯酰胺，然后取下夾子、以及環(huán)繞在玻板周圍的乳膠條，注意不要改變玻板的相對(duì)位置。
（2）在電泳槽上下即兩側(cè)電極槽中注入電泳緩沖液，注意緩沖液與凝膠上下兩端之間不要有氣泡。氣泡可用尖端彎曲的滴管排出。

（3）用微量上樣器將同樣濃度的蛋白質(zhì)樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層。對(duì)于0.3cm寬的加樣孔，推薦加樣體積以不超過(guò)20μl 為宜。用考馬斯亮藍(lán)染色法顯跡，成分很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物需加25～50μg，而樣品中只有一種或不多的幾種蛋白的話，只需1～10μg蛋白量。采用銀染顯跡時(shí)，樣品用量可減小10～100倍（按樣品的復(fù)雜程度在小于20μl的體積溶有0.01～0.5ng蛋白樣品不等）。對(duì)照孔加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品，為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) 。如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS樣品緩沖液，以防相鄰泳道樣品的擴(kuò)散。

（4）再往上槽加入余下的1×SDS電泳緩沖液。此操作緩慢小心，以防沖起樣品孔中的樣品。

（5）連接電源，電泳時(shí)通常在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可設(shè)置在120V左右。采用普通的電泳儀就可以滿足SDS-PAGE電泳的要求，為方便起見(jiàn)，也可整個(gè)SDS-PAGE電泳過(guò)程均采用恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定時(shí)間為90~120分鐘。設(shè)置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過(guò)沖。 通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白的電泳位置。（6）關(guān)閉電源并撤去連接的導(dǎo)線，棄去電泳緩沖液。連同上槽一起將凝膠夾層取出。卸下玻板，放在紙巾上，撬開(kāi)玻板。緊靠最左邊一孔凝膠上部切除一角以標(biāo)注凝膠的方位。

（三）轉(zhuǎn)膜——半干式轉(zhuǎn)移

在Western實(shí)驗(yàn)中，常用的轉(zhuǎn)印膜有PVDF膜和硝酸纖維素膜(NC膜)（表3 ）。PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇預(yù)處理（不超過(guò)15秒）再用緩沖液平衡。在轉(zhuǎn)移槽的陽(yáng)極板上按以下順序放置下物：浸過(guò)緩沖液的3張濾紙、膜、 凝膠、浸過(guò)緩沖液的3張濾紙，蓋上負(fù)極蓋，恒電流1.5-2 mA，電壓不要超過(guò)25伏通電1-2小時(shí)，膠中的蛋白質(zhì)將轉(zhuǎn)移至膜上。120kDa以上高分子量蛋白質(zhì)，用此法的轉(zhuǎn)移效率不高，可采用濕轉(zhuǎn)法。 轉(zhuǎn)膜時(shí)，具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。轉(zhuǎn)膜效果可以通過(guò)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)觀察，也可以用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。或者用考馬斯亮藍(lán)染色液對(duì)轉(zhuǎn)膜后的PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。膜可用免疫顯色法顯色，也可密閉于袋中置-20度保存。

表3  幾種膜的特點(diǎn)

（四）封閉

轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的PBST中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢起，以后所有的步驟均要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景?？捎冒退固匚芪M洗滌液，將膜放入雜交袋中，根據(jù)膜面積以0.1ml/cm²量加入WB封閉液，盡可能排盡氣泡，然后密閉袋口，在水平搖床上緩緩搖動(dòng)，室溫封閉1-2小時(shí)。如背景較高，可以在4℃ 封閉過(guò)夜。

（五）一抗孵育

用封閉液將一抗適當(dāng)稀釋（1：400-3000），將已封閉的膜置抗體溶液（溶液量根據(jù)膜面積以0.1ml/cm²計(jì)算）中，排盡氣泡，密閉袋口室溫緩緩搖動(dòng)1-3小時(shí)或4度過(guò)夜。將膜轉(zhuǎn)移至淺托盤中，用漂洗液（PBST）振搖洗3-5次，每次5-10分鐘。

（六）二抗孵育

用封閉液將二抗1：200-2000稀釋，將膜置抗體溶液（溶液量根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm²計(jì)算）中，室溫緩緩搖動(dòng)1-2小時(shí)。將膜轉(zhuǎn)移至淺托盤中，用漂洗液（PBST）振搖洗3-5次，每次5-10分鐘。

（七）蛋白檢測(cè)

目前常用的顯影方法有ECL化學(xué)發(fā)光法和DAB顯色法。具體使用細(xì)節(jié)可參考相關(guān)產(chǎn)品說(shuō)明書。

（八）膜的重復(fù)利用

 如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用WB抗體去除液處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜。