PCR成為目前開展miRNA表達譜分析的最常用方法。它靈敏快速，操作簡單。當然，若想獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果，也須花費一番努力。為此，Exiqon公司的專家分享了成功開展miRNA qPCR的五條重要建議，為大家的研究助力。

1. 選擇適當數(shù)量的重復(fù)

使用重復(fù)的目的是消除差異引起的噪音。取決于樣品的差異程度，它可能需要包含生物學(xué)和技術(shù)重復(fù)。具體需要哪種重復(fù)，這取決于實驗中引入最大變異的步驟。樣品本身需要生物學(xué)重復(fù)，而RNA提取、RT和PCR步驟需要技術(shù)重復(fù)。重復(fù)的數(shù)量取決于變異水平，但絕不能低于三個。如果只用了兩個重復(fù)，且它們差異顯著，那么就很難確定哪個是異常值。

2. 確定最佳的對照

在研究中應(yīng)當使用陰性和陽性對照。陰性對照能用來顯示污染，并確定每個分析的背景水平。使用哪個陰性對照要取決于實驗，但一般應(yīng)包括：

 無酶對照：不含酶的RT反應(yīng)，以檢查DNA污染
 無模板對照：不含模板的RT或PCR反應(yīng)，以檢查試劑是否存在污染，并顯示引物二聚體
 mock對照：帶有載體RNA（如MS2）的RT對照，以檢查提取過程中使用的載體或其他RNA是否會增加背景

實驗中也應(yīng)當使用陽性對照，以檢查樣品的質(zhì)量，并進行troubleshooting。陽性對照可以是合成的RNA spike-in。這是cDNA合成反應(yīng)的對照，也很容易判斷樣品中是否存在PCR抑制劑。

3. 開展反應(yīng)的質(zhì)量控制

為了開展質(zhì)量控制，應(yīng)當監(jiān)控擴增子的熔解溫度（Tm）和分析效率。miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR系統(tǒng)中使用SYBR Green檢測，這可以產(chǎn)生解離曲線，而不同運行之間特定擴增子的Tm應(yīng)當相同。因此，Tm可用來驗證是否獲得了相同的擴增子。解離曲線應(yīng)當只有一個峰，而不同儀器的Tm可能會有差異，這是因為不同的溫度校準。

4. 選擇良好的參考基因

選擇最佳的參考基因或參考基因組合，這至關(guān)重要，它可實現(xiàn)miRNA定量分析的標準化。如果利用含有幾百個miRNA的分析板進行篩選，標準化的最佳方法是取所有表達miRNA的平均值。在小型研究中，可使用一個或多個穩(wěn)定表達的內(nèi)源對照。這可從篩選研究中選擇。如果未開展此類研究，則應(yīng)當從文獻中挑出一些候選參考基因。

5. 選擇優(yōu)秀的數(shù)據(jù)分析軟件

適當?shù)臄?shù)據(jù)分析對您下結(jié)論很重要。利用高質(zhì)量的數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，如Exiqon GenEx，可獲得正確的miRNA圖譜。

在Exiqon GenEx中，一個易用的互動助手將指導(dǎo)您導(dǎo)入數(shù)據(jù)，選擇適當?shù)膮⒖蓟?，標準化及最后的?shù)據(jù)分析。

通過簡單的幾步，Exiqon GenEx就能生成復(fù)雜的統(tǒng)計表以及可立即發(fā)表的圖片，讓您清晰地查看結(jié)果。

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