摘要：以鐵皮石斛莖節(jié)段為外植體，研究不同濃度的外源激素配比對鐵皮石斛誘導(dǎo)和增殖的影響。實驗表明，不定芽誘導(dǎo)最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方是1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂，最佳增殖培養(yǎng)基配方是1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂+10%椰子汁。
關(guān)鍵詞:鐵皮石斛;不空等;誘導(dǎo);增值
鐵皮石斛（Dendrobium officinale）又名黑節(jié)草，屬氣生蘭科草本植物。其所含主要成分石斛多糖和石斛堿，具有滋陰、益胃、生津止渴、潤肺止咳、強(qiáng)壯及增強(qiáng)免疫活性的作用[4]，為南亞和東南亞地區(qū)著名的中草藥[5]。在我國主要分布于江西、廣西、廣東、貴州、云南、安徽、浙江、湖南、陜西、河南、福建等地[1-3]，多分布于海拔近千米的山地半陰濕巖石上，一般均能耐-5℃的低溫[4]。在野生狀態(tài)下，鐵皮石斛繁殖速率低下、生長緩慢，加之掠奪性采挖，使其野生資源日益減少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足國內(nèi)外市場經(jīng)濟(jì)發(fā)展和臨床醫(yī)學(xué)的需要，因此鐵皮石斛人工種植的規(guī)模迅速擴(kuò)大[6-7]。常規(guī)條件下，鐵皮石斛人工繁殖較困難，組織培養(yǎng)技術(shù)在鐵皮石斛生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。本實驗以鐵皮石斛莖段為外植體，并直接從莖段誘導(dǎo)叢生芽增殖，獲得大量的試管苗，建立了鐵皮石斛的快速繁殖體系，縮短了鐵皮石斛無性繁殖的周期，為進(jìn)一步加快鐵皮石斛組織培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1實驗材料
供試材料鐵皮石斛外植體采自寧波市鹿亭鄉(xiāng)白鹿村。
1.2 外植體的消毒與培養(yǎng)
從鐵皮石斛植株上選擇新生健壯的莖段作為外植體，摘去葉片和膜質(zhì)葉鞘，剪取2cm長帶莖節(jié)的小段，用洗潔劑小心清洗后，置流水下沖洗10min備用。在超凈工作臺上用無菌水浸泡5min，75％的酒精消毒5s，0.1％HgCl滅菌5min后，再用無菌水沖洗數(shù)次，放入墊有干無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，以吸去多余水分。在莖段兩端各切去少許，保留莖節(jié)接入準(zhǔn)備好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基插入10個莖節(jié)小段。經(jīng)一段時間的誘導(dǎo)，外植體膨大并產(chǎn)生原球莖，將誘導(dǎo)形成的原球莖轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。選擇基本培養(yǎng)基均為1/2MS+7.5g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH 5.7～5.8。培養(yǎng)條件：溫度21~23℃，光強(qiáng)為2000Lx，光照時間12h/d。
1.3不定芽的誘導(dǎo)
以不同配比的激素：6-BA，萘乙酸（NAA），篩選出適合不定芽誘導(dǎo)的激素種類。莖段經(jīng)過消毒后，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個處理20株，每3天觀察不定芽的誘導(dǎo)情況，比較誘導(dǎo)率與誘導(dǎo)時間，篩選出最適合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
1.4不定芽的增殖
添加6-BA、NAA、椰子汁，選取大小一致的不定芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每3d觀察增殖情況。
2 試驗結(jié)果
2.1不定芽的誘導(dǎo)
本試驗將鐵皮石斛莖段外植體接種于1/2MS培養(yǎng)基附加不同濃度6-BA和NAA的培養(yǎng)基上，進(jìn)行初代培養(yǎng)。外植體培養(yǎng)30d后的誘導(dǎo)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，高濃度的NAA會抑制腋芽的萌發(fā)；6-BA在試驗中對腋芽誘導(dǎo)的作用表現(xiàn)為：隨著NAA濃度的增加，6-BA作用明顯；綜合考慮芽誘導(dǎo)率和健壯度等因素，處理8（1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）最適合腋芽誘導(dǎo)，此時腋芽的誘導(dǎo)率最高，芽健壯度也較好。
表1 不定芽的誘導(dǎo)
|
編號 |
6-BA
（mg/L） |
NAA
（mg/L） |
誘導(dǎo)倍數(shù) |
誘導(dǎo)生長情況 |
|
0 |
0 |
0 |
1.0 |
正常 |
|
1 |
0.5 |
0.1 |
1.4 |
正常，愈傷組織少 |
|
2 |
0.5 |
0.2 |
1.2 |
正常，愈傷組織少 |
|
3 |
0.5 |
0.5 |
1.1 |
芽少，深綠色，有根 |
|
4 |
1.0 |
0.1 |
2.1 |
正常， |
|
5 |
1.0 |
0.2 |
1.5 |
正常，芽飽滿，少量根 |
|
6 |
1.0 |
0.5 |
1.2 |
正常，有根 |
|
7 |
1.5 |
0.1 |
4.8 |
芽分化較多，芽細(xì)弱 |
|
8 |
1.5 |
0.2 |
3.8 |
正常，芽健康 |
|
9 |
1.5 |
0.5 |
2.3 |
正常，有根 |
|
10 |
2.0 |
0.1 |
6.2 |
不定芽畸形 |
|
11 |
2.0 |
0.2 |
4.3 |
不定芽畸形 |
|
12 |
2.0 |
0.5 |
2.9 |
不定芽玻璃化，畸形多 |
2.2不定芽的增殖
將誘導(dǎo)培養(yǎng)中大小一致的不定芽轉(zhuǎn)接至含不同濃度的6-BA和NAA的培養(yǎng)基中，濃度梯度同誘導(dǎo)試驗處理梯度。培養(yǎng)30d后，結(jié)果表現(xiàn)為，降低NAA與6-BA濃度，在處理5（1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）的濃度配比下，增殖倍數(shù)為3.3，綜合觀察下不定芽生長狀況最好，并在后續(xù)的繼代培養(yǎng)中保持增殖倍數(shù)3倍以上。在增殖培養(yǎng)基上添加10%的椰子汁，鐵皮石斛增殖苗增值率有所提高，增殖倍數(shù)達(dá)4倍左右（表2）。
表2 不定芽的增殖
|
編號 |
6-BA
（mg/L） |
NAA
（mg/L） |
增殖倍數(shù) |
生長情況 |
|
1 |
0.5 |
0.1 |
2.0 |
正常 |
|
2 |
0.5 |
0.2 |
1.5 |
正常 |
|
3 |
0.5 |
0.5 |
1.4 |
芽少，有根 |
|
4 |
1.0 |
0.1 |
3.3 |
正常 |
|
5 |
1.0 |
0.2 |
3.3 |
正常，芽飽滿 |
|
6 |
1.0 |
0.5 |
1.9 |
正常，有少量根 |
|
7 |
1.5 |
0.1 |
4.9 |
芽多，偏小 |
|
8 |
1.5 |
0.2 |
3.5 |
正常，芽多，成長緩慢 |
|
9 |
1.5 |
0.5 |
3.3 |
正常，有根 |
|
10 |
2.0 |
0.1 |
6.9 |
不定芽畸形 |
|
11 |
2.0 |
0.2 |
5.3 |
不定芽畸形 |
|
12 |
2.0 |
0.5 |
5.0 |
不定芽畸形 |
3 討論
本研究表明，在不定芽誘導(dǎo)試驗中，NAA在與6-BA搭配使用下，表現(xiàn)為低濃度的NAA促進(jìn)鐵皮石斛腋芽萌發(fā)，誘導(dǎo)芽的分化；過高濃度NAA則會抑制腋芽的萌發(fā)，這與郭洪波[8]的研究結(jié)論相同。張治國等[9-10]研究了鐵皮石斛原球莖在VW、N6、1/2MS、B5、KC等6種培養(yǎng)基上的增殖和分化情況，結(jié)果表明，附加馬鈴薯提取液和植物激素后的6種基本培養(yǎng)基，原球莖均可分化，其中1/2MS是原球莖增殖和分化的最適宜培養(yǎng)基。我們的研究結(jié)果也與張治國等的研究結(jié)果一致：不定芽誘導(dǎo)的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方是1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂，最佳增殖培養(yǎng)基配方是1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂+10%椰子汁。本試驗以莖段為外植體，具有易取材，繁殖系數(shù)高，繁殖速度快，周期短等優(yōu)點(diǎn)，在沒有種子的情況下利用莖段外植體同樣能快速生產(chǎn)鐵皮石斛植株。
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