雞矢藤揮發(fā)油體外抗乙型肝炎病毒作用研究
【摘要】 目的對(duì)雞矢藤揮發(fā)油抗HBV作用進(jìn)行體外抗病毒實(shí)驗(yàn)研究。方法采用水蒸氣蒸餾法提取雞矢藤揮發(fā)油，以HepG 2.2.15細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，檢測(cè)雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HepG 2.2.15肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒性。并在最大無毒濃度下觀察雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞表達(dá)HBsAg，HBeAg的影響。結(jié)果雞矢藤揮發(fā)油在31～2 000 mg/L的濃度范圍內(nèi)，對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞有明顯抑制作用，TC50為1 550 mg/L, TC0為500 mg/L。在最大無毒濃度下，雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HBsAg最大抑制率為72.49%，治療指數(shù)為6.74，對(duì)HBeAg最大抑制率為23.64%。結(jié)論雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg，HBeAg分泌有較好抑制作用。 【關(guān)鍵詞】 雞矢藤; 乙型肝炎病毒; HepG2.2.15細(xì)胞株; 揮發(fā)油; 乙肝表面抗原; 乙肝e抗原 雞矢藤是茜草科(Rubiaceae)雞矢藤屬(Paederia) 多年生蔓性草質(zhì)藤本植物雞矢藤Paeder scandens (Lour.) Merri.的全株，其味甘酸，平和，是一種常用中草藥[1]，廣泛分布于中國(guó)、日本、韓國(guó)、越南、泰國(guó)、菲律賓、印度等，以及美國(guó)西海岸。傳統(tǒng)中藥經(jīng)驗(yàn)表明其在黃疸、肝炎、肝脾腫大等治療方面具有一定的作用[2，3]，其作為一種有效的抗乙肝輔助性草藥，在中藥中配伍很廣;同時(shí)其嫩莖葉又是廣東;海南一帶居民喜歡吃的美味野菜[4]，具有很高的食用安全性。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)雞矢藤揮發(fā)油抗HBV作用進(jìn)行了體外抗病毒的實(shí)驗(yàn)研究， 以期為雞矢藤的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。 1 材料 1.1 雞矢藤藥粉雞矢藤地上部分采集于廣東湛江市郊，經(jīng)廣東醫(yī)學(xué)院生化教研室黃迪南教授鑒定，為雞矢藤Paederia scandens(Lour.)Merr。陰干，中藥粉碎機(jī)粉碎并過60目篩，備用。 1.2 HepG2.2.15細(xì)胞株購于北京大學(xué)附屬醫(yī)院病毒研究所。 1.3 試劑高糖DMEM(Gibco公司)，新生胎牛血清(Gibco公司),G418(Gibco公司),MTT(Sigma公司)，青霉素、鏈霉素(碧云天公司)，胰酶消化液(碧云天公司);HBsAg檢測(cè)試劑盒(ELISA法)，上?？迫A生物工程有限公司產(chǎn)品;HBeAg檢測(cè)試劑盒(ELISA法)，上?？迫A生物工程有限公司產(chǎn)品。 2 方法 2.1 雞矢藤揮發(fā)油的提取用水蒸氣法提取雞矢藤的揮發(fā)油。精密稱取雞矢藤藥粉100 g，加1 500 ml三蒸水于2 000 ml燒瓶中，50℃水浴浸泡8 h。接揮發(fā)油測(cè)定器，電熱套加熱。微沸開始計(jì)時(shí)12 h回流。冷卻后，收集測(cè)定管中水層并用1∶1(V∶V)乙醚萃取3次。測(cè)定器用乙醚洗滌兩次并收集，油層另外收集。乙醚萃取液加入無水硫酸鈉干燥過夜，過濾。揮掉乙醚后所得物合并油層得雞矢藤揮發(fā)油。 2.2 HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg規(guī)律試驗(yàn)將HepG2.2.15細(xì)胞按照1×105/ml接種于24孔板上，設(shè)置6個(gè)平行孔，每孔加含有G418的培養(yǎng)基1ml,另設(shè)置6個(gè)平行孔，每孔加不含有G418的培養(yǎng)基1 ml。每天換一次培養(yǎng)液并收集上清儲(chǔ)存于-20℃，共6 d。用ELISA法檢測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg、HBeAg的分泌量，以P/N值>2.1為陽性。同法重復(fù)試驗(yàn)并檢測(cè)共3次。 2.3 MTT法檢測(cè)雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞毒性試驗(yàn)以高糖DMEM、青霉素、鏈霉素、15%胎牛血清、G418濃度為380 mg/L的條件培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞并傳代。用含有1%DMSO(V∶V)的培養(yǎng)基10 ml溶解50 mg雞矢藤揮發(fā)油，配制成濃度為5g/L的儲(chǔ)備液，4℃下保存。用時(shí)取出用培養(yǎng)基稀釋成2 000，1 000，500，250，125，62，31，15 mg/L等8個(gè)濃度梯度。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2.2.15細(xì)胞以1×105/ml接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后更換含有不同濃度揮發(fā)油的培養(yǎng)基100 μl。并設(shè)置只用含1%DMSO培養(yǎng)基培養(yǎng)的對(duì)照孔，含1%DMSO培養(yǎng)基而無細(xì)胞的空白孔，每組均設(shè)定6個(gè)平行孔。繼續(xù)分別培養(yǎng)24，48，72 h后吸盡培養(yǎng)液，每孔更換為含有0.5 g/L的MTT培養(yǎng)液100 μl,37℃下培養(yǎng)4h后吸盡培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO，孵育20 min，充分振蕩溶解結(jié)晶紫。然后在490 nm波長(zhǎng)與570 nm參考波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的OD值，根據(jù)各孔OD值求出揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的抑制率，并通過Reed-Muench法求出雞矢藤揮發(fā)油的(半數(shù)中毒濃度)TC50。并通過CPE法鏡檢下確定雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的(最大無毒濃度)TC0。細(xì)胞抑制百分率(%)=1-給藥組OD-空白組OD對(duì)照組OD-空白組OD×100%(n=6)Reed-Muench公式：TC50=Antilog(B+50-BA-B×C)(A=log>50%抑制的藥物濃度，B=log<50%抑制的藥物濃度，C=log稀釋倍數(shù)) CPE細(xì)胞病變法，是以正常細(xì)胞無自然蛻變，不引起細(xì)胞病變的藥物最低濃度作為細(xì)胞的最大無毒濃度(TC0)。見表1。表1 CPE細(xì)胞病變程度對(duì)照 2.4 雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg、HBeAg分泌的影響根據(jù)對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果，以揮發(fā)油最大無毒濃度作為上限，選擇最大無毒濃度倍比稀釋成6個(gè)濃度梯度為：500，250，125，62，31，15 mg/L。將HepG2.2.15細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μl，1天后更換含有不同濃度的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行孔。48 h后，收集上清液于-20℃保存，用HBsAg、HBeAg試劑盒檢測(cè)不同濃度藥物對(duì)HBsAg、HBeAg的抑制率。試驗(yàn)按照同樣的方法重復(fù)3次。HBsAg、HBeAg抑制率(%)=(空白P/N-藥物P/N)/(空白P/N)×100%(P/N:)治療指數(shù)TI=TC50/IC50(TI>2，屬于有效低毒效果;1 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以 ±s表示，進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為有顯著差異。 3 結(jié)果 3.1 雞矢藤揮發(fā)油提取經(jīng)過水蒸氣法得到半固體狀有特殊氣味的褐黃色雞矢藤揮發(fā)油0.23 g，得率為0.23%。 3.2 HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg規(guī)律結(jié)果顯示，經(jīng)過380 mg/L G418篩選過的HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)1 d后即開始分泌HBsAg、HBeAg，通過試劑盒檢測(cè)，不含G418組1～6 d的HBsAg分泌水平均處于陽性。5 d后基本上達(dá)到高峰水平，含有G418組1～2 d內(nèi)HBsAg分泌為陰性，但接近陽性。2 d后呈陽性，且分泌量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。HBeAg分泌量無論是含有G418組還是不含G418組，均表現(xiàn)為高表達(dá)。結(jié)果見表1。表1 不同天數(shù)HepG2.2.15細(xì)胞對(duì)HBsAg、HBeAg的分泌量 3.3 雞矢藤揮發(fā)油細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞在較高濃度500 mg/L以上時(shí)有毒性抑制作用，而在15～500 mg/L濃度內(nèi)，細(xì)胞鏡檢查下無明顯病變，表現(xiàn)出一定的安全性。根據(jù)CPE檢測(cè)雞矢藤揮發(fā)油的最大無毒濃度TC0為500 mg/L。根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算出雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞半數(shù)致死濃度TC50為1 550 mg/L。結(jié)果見表2及圖1。表2 雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性 3.4 雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg、HBeAg分泌的抑制結(jié)果見表3所示,雞矢藤揮發(fā)油在最大無毒濃度范圍內(nèi)對(duì)HBsAg的分泌有較好的抑制作用，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。在最大無毒濃度下，HBsAg抑制率達(dá)到了72.49%，HBeAg的抑制率達(dá)到了23.64%，HBsAg的抑制高于HBeAg的抑制(見圖2)，經(jīng)Reed-Muench公式計(jì)算，HBsAg抑制的半數(shù)有效濃度IC50為230 mg/L。雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HBsAg的治療指數(shù)為6.74。圖1 雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的抑制曲線表3 雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制率圖2 雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制曲線 4 討論 HepG2.2.15細(xì)胞是轉(zhuǎn)染了HBV DNA的HepG2細(xì)胞，它能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定地在培養(yǎng)液上清中分泌HBsAg、HBeAg和HBV顆粒[5]。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者多利用此細(xì)胞株進(jìn)行體外抗乙肝病毒藥物的篩選，并對(duì)其實(shí)際意義進(jìn)行研究。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，該細(xì)胞株培養(yǎng)一天以后便可以檢測(cè)到HBeAg、HBsAg的分泌,與報(bào)道一致[6],細(xì)胞分泌HBeAg的濃度較HBsAg高。往往需要培養(yǎng)2 d左右HBsAg濃度才能達(dá)到一個(gè)較好的篩選濃度，根據(jù)有無添加G418的實(shí)驗(yàn)證明，G418對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，是HepG2.2.15細(xì)胞株增殖緩慢原因之一。而經(jīng)過G418陽性篩選過的細(xì)胞株在藥物篩選實(shí)驗(yàn)中即使不添加G418培養(yǎng)一樣高效率分泌HBeAg、HBsAg，并且生長(zhǎng)速率要高于含有G418培養(yǎng)組，因此作為一次性使用時(shí)的藥物篩選細(xì)胞，添加無G418培養(yǎng)基培養(yǎng)效果更好，縮短了細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間。 揮發(fā)油作為一種脂溶性物質(zhì)，往往需要添加助溶劑來分散在培養(yǎng)液中，曾見報(bào)道用5%吐溫80作為助溶劑[7]，但經(jīng)過本課題組的驗(yàn)證，0.05%～1%的吐溫80均對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞有強(qiáng)烈的毒性作用，而1%的DMSO對(duì)細(xì)胞無明顯影響。因此采用1%DMSO作為雞矢藤揮發(fā)油的助溶劑。 雞矢藤揮發(fā)油中含有硫成分[8～10],是其特殊氣味的主要來源。而從相對(duì)含量來看，雞矢藤揮發(fā)油的主要成分為乙酸異戊酯(20.21%)、乙酸苯甲酯 (8.04%)、十五碳酸乙酯(6.79%)、軟脂酸(6.78%)、癸酸異戊酯(5.72%);另外還有樟腦、乙酸龍腦酯、丁香酚等有藥理作用的成分[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雞矢藤揮發(fā)油對(duì)于HepG2.2.15細(xì)胞的毒性較低，通過CPE法鏡檢確定最大無毒濃度為500 mg/L。在此濃度范圍以內(nèi)，雞矢藤揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的HBsAg、HBeAg分泌具有較好的抑制作用，并有良好的量效關(guān)系。HBsAg的抑制率遠(yuǎn)高于HBeAg的抑制率可能與HepG2.2.15細(xì)胞高分泌HBeAg，較低分泌HBsAg量有關(guān)。由于利用細(xì)胞株進(jìn)行藥物的體外篩選存在著一定的局限性，因此，對(duì)于上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有待進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。 【參考文獻(xiàn)】 |
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