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用軟件設(shè)計(jì)引物（Primer Premier & Oligo） 使用不合適的PCR 引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗：表現(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等?，F(xiàn)在PCR 引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行，軟件的立足點(diǎn)也是按照引物設(shè)計(jì)的基本原則，只是更加快速和自動(dòng)化而已。我們可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁(yè)，如著名的primer3（http://frodo.wi./），得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專(zhuān)業(yè)軟件。一般來(lái)說(shuō)，專(zhuān)門(mén)進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)的專(zhuān)業(yè)軟件功能更為強(qiáng)大，但使用起來(lái)卻不太容易。 軟件的引物設(shè)計(jì)功能主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：首先是引物分析評(píng)價(jià)功能，該功能只有少數(shù)商業(yè)版軟件能夠做到，其中以“Oligo 6”最優(yōu)秀；其次是引物的自動(dòng)搜索功能，各種軟件在這方面的側(cè)重點(diǎn)不同，因此自動(dòng)搜索的結(jié)果也不盡相同。據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)，自動(dòng)搜索功能以“Premier Primer”為最強(qiáng)且方便使用，“Oligo 6”其次，其他軟件如“Vector NTI Suit”、“DNAsis”、“Omiga”和“Dnastar”都帶有引物自動(dòng)搜索功能，但搜索結(jié)果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自動(dòng)搜索的基礎(chǔ)上還要輔以人工分析。筆者認(rèn)為引物設(shè)計(jì)軟件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”軟件合并使用，以“Premier”進(jìn)行自動(dòng)搜索，“Oligo”進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，如此可快速設(shè)計(jì)出成功率很高的引物。 Primer Premier 5.0 的使用技巧簡(jiǎn)介 1. 功能 “Premier”的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設(shè)計(jì)、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析和DNA 基元(motif)查找。“Premier”還具有同源性分析功能，但并非其特長(zhǎng)，在此略過(guò)。此外，該軟件還有一些特殊功能，其中最重要的是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，另外還有序列“朗讀”、DNA 與蛋白序列的互換、語(yǔ)音提示鍵盤(pán)輸入等等。 有時(shí)需要根據(jù)一段氨基酸序列反推到DNA 來(lái)設(shè)計(jì)引物，由于大多數(shù)氨基酸（20 種常見(jiàn)結(jié)構(gòu)氨基酸中的18 種）的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列時(shí)，會(huì)遇到部分堿基的不確定性。這樣設(shè)計(jì)并合成的引物實(shí)際上是多個(gè)序列的混和物，它們的序列組成大部分相同，但在某些位點(diǎn)有所變化，稱之為簡(jiǎn)并引物。遺傳密碼規(guī)則因物種或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的不同而異，比如在線粒體內(nèi)的遺傳密碼與細(xì)胞核是不一樣的?！癙remier”可以針對(duì)模板DNA 的來(lái)源以相應(yīng)的遺傳密碼規(guī)則轉(zhuǎn)換DNA 和氨基酸序列。軟件共給出八種生物亞結(jié)構(gòu)的不同遺傳密碼規(guī)則供用戶選擇，有纖毛蟲(chóng)大核（Ciliate Macronuclear）、無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體（Invertebrate Mitochondrion）、支原體（Mycoplasma）、植物線粒體（Plant Mitochondrion）、原生動(dòng)物線粒體（Protozoan Mitochondrion）、一般標(biāo)準(zhǔn)（Standard）、脊椎動(dòng)物線粒體（Vertebrate Mitochondrion）和酵母線粒體（Yeast Mitochondrion）。 2. 使用步驟及技巧 其主要功能在主界面上一目了然。限制性酶切點(diǎn)分析及基元查找功能比較簡(jiǎn)單，點(diǎn)擊該功能按鈕后，選擇相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等），按確定即可。常見(jiàn)的限制性內(nèi)切酶和基元一般都可以找到。你還可以編輯或者添加新限制性內(nèi)切酶或基元。 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，打開(kāi)DNA序列后點(diǎn)擊按鈕primer，出現(xiàn)“search criteria”窗口，有多種參數(shù)可以調(diào)整。搜索目的（Seach For）有三種選項(xiàng)，PCR 引物（PCR Primers），測(cè)序引物（Sequencing Primers），雜交探針（Hybridization Probes）。搜索類(lèi)型(Search Type)可選擇分別或同時(shí)查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成對(duì)查找（Pairs），或者分別以適合上、下游引物為主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外還可改變選擇區(qū)域（Search Ranges），引物長(zhǎng)度（Primer Length），選擇方式（Search Mode），參數(shù)選擇（Search Parameters）等等。使用者可根據(jù)自己的需要設(shè)定各項(xiàng)參數(shù)。如果沒(méi)有特殊要求，建議使用默認(rèn)設(shè)置。然后按search，隨之出現(xiàn)的Search Progress 窗口中顯示Search Completed 時(shí)，再按OK，這時(shí)搜索結(jié)果以表格的形式出現(xiàn)，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成對(duì)顯示(Pairs)。默認(rèn)顯示為成對(duì)方式，并按優(yōu)劣次序（Rating）排列，滿分為100，即各指標(biāo)基本都能達(dá)標(biāo)。 點(diǎn)擊其中一對(duì)引物，如第1#引物，并把上述窗口挪開(kāi)或退出，顯示“Peimer Premier”主窗口， 所得結(jié)果分三部分，最上面是圖示PCR 模板及產(chǎn)物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質(zhì)，最下面是四種重要指標(biāo)的分析，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin），二聚體（Dimer），錯(cuò)誤引發(fā)情況（False Priming），及上下游引物之間二聚體形成情況（Cross Dimer）。當(dāng)所分析的引物有這四種結(jié)構(gòu)的形成可能時(shí)，按鈕由變成，點(diǎn)擊該按鈕，在左下角的窗口中就會(huì)出現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的形成情況。一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒(méi)有，只有。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火溫度，可參考應(yīng)用。 在需要對(duì)引物進(jìn)行修飾編輯時(shí)，如在5’端加入酶切位點(diǎn)，可點(diǎn)擊，然后修改引物序列。若要回到搜索結(jié)果中，則點(diǎn)擊按鈕。如果要設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，只需根據(jù)源氨基酸序列的物種來(lái)源選擇前述的八種遺傳密碼規(guī)則，反推至DNA 序列即可。對(duì)簡(jiǎn)并引物的分析不需像一般引物那樣嚴(yán)格?？傊?，“Premier”有優(yōu)秀的引物自動(dòng)搜索功能，同時(shí)可進(jìn)行部分指標(biāo)的分析，而且容易使用，是一個(gè)相當(dāng)不錯(cuò)的軟件。 3.下載鏈接：http://cid-6431dec21ba3f8f8.skydrive./self.aspx/software/oligo6.65.rar Oligo 6.22 使用技巧簡(jiǎn)介 1. 功能 在專(zhuān)門(mén)的引物設(shè)計(jì)軟件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分復(fù)雜，但初學(xué)者容易被其復(fù)雜的圖表嚇倒。Oligo 5.0 的初始界面是兩個(gè)圖：Tm 圖和ΔG 圖；Oligo 6.22 的界面更復(fù)雜，出現(xiàn)三個(gè)圖，加了個(gè)Frq 圖?！癘ligo”的功能比“Premier”還要單一，就是引物設(shè)計(jì)。但它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至于能風(fēng)靡全世界。 2. 使用（以O(shè)ligo 6.22 為例） Oligo 6.22 的啟動(dòng)界面顯示的三個(gè)指標(biāo)分別為T(mén)m、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，為鄰近6至7 個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，起動(dòng)窗口的cascade 排列方式不太方便，可從windows菜單改為tili 方式。如果覺(jué)得太擁擠，可去掉一個(gè)指標(biāo)，如Frq，這樣界面的結(jié)構(gòu)同于Oligo5.0，只是顯示更清楚了。 在設(shè)計(jì)時(shí)，可依據(jù)圖上三種指標(biāo)的信息選取序列，如果覺(jué)得合適，可點(diǎn)擊Tm 圖塊上左下角的Upper 按鈕，選好上游引物，此時(shí)該按鈕變成，表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。G 值反映了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，最好引物的G 值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對(duì)低。 Tm 值曲線以選取72℃附近為佳，5’到3’的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq 曲線為“Oligo 6”新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片段存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)，宜選用3’端Frq 值相對(duì)較低的片段。 當(dāng)上下游引物全選好以后，需要對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)并根據(jù)評(píng)價(jià)對(duì)引物進(jìn)行修改。首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cross dimer）。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測(cè)（非克?。┬訮CR，對(duì)引物位置、產(chǎn)物大小要求較低，因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。一般來(lái)說(shuō)，這兩項(xiàng)結(jié)構(gòu)的能值以不超過(guò)4.5 為好。 當(dāng)然，在設(shè)計(jì)克隆目的的PCR 引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切位點(diǎn)，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會(huì)太低。這種PCR 需要通過(guò)靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到最好效果，對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測(cè)就不應(yīng)要求太高。第三項(xiàng)檢查為GC 含量，以45-55％為宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC 含量不能被控制在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。如果PCR 的模板不是基因組DNA，而是一個(gè)特定模板序列，那么最好還進(jìn)行False priming site 的檢測(cè)。這項(xiàng)檢查 可以看出引物在非目的位點(diǎn)引發(fā)PCR 反應(yīng)的可能性。如果引物在錯(cuò)配位點(diǎn)的引發(fā)效率比較高，就可能出假陽(yáng)性的PCR 結(jié)果。一般在錯(cuò)配引發(fā)效率以不超過(guò)100 為好，但對(duì)于特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率為450 以上，而在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率為130，那么這對(duì)引物也是可以接受的。當(dāng)我們結(jié)束以上四項(xiàng)檢測(cè)，按Alt+P 鍵彈出PCR 窗口，其中總結(jié)性地顯示該引物的位置、產(chǎn)物大小、Tm 值等參數(shù)，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)。 由于“Oligo”軟件的引物自動(dòng)搜索功能與“Primer Premier 5”的相類(lèi)似，并且似乎并不比后者更好用，在此不再贅述。其實(shí)，使用軟件自動(dòng)搜索引物就是讓計(jì)算機(jī)按照人的要求去尋找最佳引物，如果參數(shù)設(shè)置得當(dāng)將大大提高工作效率。 3.下載鏈接：http://cid-6431dec21ba3f8f8.skydrive./self.aspx/software/Primer%20Premier%205.rar 除了本地引物設(shè)計(jì)軟件之外，現(xiàn)在還有一些網(wǎng)上引物設(shè)計(jì)軟件，如由Whitehead Institute開(kāi)發(fā)的“Primer 3”等。該軟件的獨(dú)特之處在于，對(duì)全基因組PCR 的引物設(shè)計(jì)；可以將設(shè)計(jì)好的引物對(duì)后臺(tái)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)并排除可引發(fā)錯(cuò)配的引物。因此建議經(jīng)常做全基因組PCR 的用戶試用。 用軟件設(shè)計(jì)引物（Primer Premier & Oligo）細(xì)節(jié)補(bǔ)充 在NCBI上搜索到我們感興趣的基因，找到該基因的mRNA，在CDS選項(xiàng)中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，Copy該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對(duì)象。 一：使用Primer Premier 5 打開(kāi)Primer Premier5，點(diǎn)擊File-New-DNA sequence, 出現(xiàn)輸入序列窗口，Copy目的序列在輸入框內(nèi)（選擇As），此窗口內(nèi)，序列也可以直接翻譯成蛋白。點(diǎn)擊Primer，進(jìn)入引物窗口。 此窗口可以鏈接到“引物搜索”、“引物編輯”以及“搜索結(jié)果”選項(xiàng)，點(diǎn)擊Search按鈕，進(jìn)入引物搜索框，選擇“PCR primers”，“Pairs”，設(shè)定搜索區(qū)域和引物長(zhǎng)度和產(chǎn)物長(zhǎng)度； 在Search Parameters里面，可以設(shè)定相應(yīng)參數(shù)。一般若無(wú)特殊需要，參數(shù)選擇默認(rèn)即可，但產(chǎn)物長(zhǎng)度可以適當(dāng)變化，因?yàn)?00～200bp的產(chǎn)物電泳跑得較散，所以可以選擇300～500bp； 點(diǎn)擊OK，軟件即開(kāi)始自動(dòng)搜索引物，搜索完成后，會(huì)自動(dòng)跳出結(jié)果窗口，搜索結(jié)果默認(rèn)按照評(píng)分（Rating）排序，點(diǎn)擊其中任一個(gè)搜索結(jié)果，可以在“引物窗口”中，顯示出該引物的綜合情況，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各種信息等。 對(duì)于引物的序列，可以簡(jiǎn)單查看一下，避免出現(xiàn)下列情況：3’端不要以A結(jié)尾，最好是G或者C，T也可以；3’不要出現(xiàn)連續(xù)的3個(gè)堿基相連的情況，比如GGG或 CCC，否則容易引起錯(cuò)配。此窗口中需要著重查看的包括：Tm應(yīng)該在55～70度之間，GC％應(yīng)該在45％～55％間，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下較好。該窗口的最下面列出了兩條引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，包括，發(fā)卡，二聚體，引物間交叉二聚體和錯(cuò)誤引發(fā)位置。若按鈕顯示為紅色，表示存在該二級(jí)結(jié)構(gòu)，點(diǎn)擊該紅色按鈕，即可看到相應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)位置圖示。最理想的引物，應(yīng)該都不存在這些二級(jí)結(jié)構(gòu)，即這幾個(gè)按鈕都顯示為“None”為好。但有時(shí)很難找到各個(gè)條件都滿足的引物，所以要求可以適當(dāng)放寬，比如引物存在錯(cuò)配的話，可以就具體情況考察該錯(cuò)配的效率如何，是否會(huì)明顯影響產(chǎn)物。對(duì)于引物具體詳細(xì)的評(píng)價(jià)需要借助于Oligo來(lái)完成，Oligo自身雖然帶有引物搜索功能，但其搜索出的引物質(zhì)量感覺(jué)不如Primer5。 在Primer5窗口中，若覺(jué)得某一對(duì)引物合適，可以在搜索結(jié)果窗口中，點(diǎn)擊該引物，然后在菜單欄，選擇File-Print-Current pair，使用PDF虛擬打印機(jī)，即可轉(zhuǎn)換為Pdf文檔，里面有該引物的詳細(xì)信息；或是選擇菜單欄下的save to database保存起來(lái)。 二：使用Oligo 在Oligo軟件界面，F(xiàn)ile菜單下，選擇Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，該序列已經(jīng)被保存為Seq文件），會(huì)跳出來(lái)兩個(gè)窗口，分別為Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，點(diǎn)擊最左下角的按鈕，會(huì)出來(lái)引物定位對(duì)話框，輸入候選的上游引物序列位置（Primer5已經(jīng)給出）即可，而引物長(zhǎng)度可以通過(guò)點(diǎn)擊Change－Current oligo length來(lái)改變。定位后，點(diǎn)擊Tm窗口的Upper按鈕，確定上游引物，同樣方法定位下游引物位置，點(diǎn)擊Lower按鈕，確定下游引物。引物確定后，即可以充分利用Analyze菜單中各種強(qiáng)大的引物分析功能了。 Analyze中，第一項(xiàng)為Key info，點(diǎn)擊Selected primers，會(huì)給出兩條引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method計(jì)算，會(huì)比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中還給出引物的Delta G和3’端的Delta G。3’端的Delta G過(guò)高，會(huì)在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起DNA聚合反應(yīng)，因此此項(xiàng)絕對(duì)值應(yīng)該小一些，最好不要超過(guò)9。 Analyze中第二項(xiàng)為Duplex Formation，即二聚體形成分析，可以選擇上游引物或下游引物，分析上游引物間二聚體形成情況和下游引物間的二聚體情況，還可以選擇Upper/Lower，即上下游引物之間的二聚體形成情況。引物二聚體是影響PCR反應(yīng)異常的重要因素，因此應(yīng)該避免設(shè)計(jì)的引物存在二聚體，至少也要使設(shè)計(jì)的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其Delta G值應(yīng)該偏低，一般不要使其超過(guò)4.5kcal/mol，結(jié)合堿基對(duì)不要超過(guò)3個(gè)。Oligo此項(xiàng)的分析窗口中分別給出了3’端和整個(gè)引物的二聚體圖示和Delta G值。 Analyze中第三項(xiàng)為Hairpin Formation，即發(fā)夾結(jié)構(gòu)分析?？梢赃x擇上游或者下游引物，同樣，Delta G值不要超過(guò)4.5kcal/mol，堿基對(duì)不要超過(guò)3個(gè)。 Analyze中第四項(xiàng)為Composition and Tm，會(huì)給出上游引物、下游引物和產(chǎn)物的各個(gè)堿基的組成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之間的GC％不要相差太大。Tm值共有3個(gè)，分別采用三種方法計(jì)算出來(lái)，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一種應(yīng)該是Primer5所采用的方法，Tm值可以控制在50～70度之間。 第五項(xiàng)為False Priming Sites，即錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)，在Primer5中雖然也有False priming分析，但不如oligo詳細(xì)，并且oligo會(huì)給我正確引發(fā)效率和錯(cuò)誤引發(fā)效率，一般的原則要使錯(cuò)誤引發(fā)效率在100以下，當(dāng)然有時(shí)候正確位點(diǎn)的引發(fā)效率很高的話，比如達(dá)到400～500，錯(cuò)誤引發(fā)效率超過(guò)100幅度若不大的話，也可以接受。 Analyze中，有參考價(jià)值的最后一項(xiàng)是“PCR”，在此窗口中，是基于此對(duì)引物的PCR反應(yīng)Summary，并且給出了此反應(yīng)的最佳退火溫度，另外，提供了對(duì)于此對(duì)引物的簡(jiǎn)短評(píng)價(jià)。若該引物有不利于PCR反應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在，并且Delta G值偏大的話，Oligo在最后的評(píng)價(jià)中會(huì)注明，若沒(méi)有注明此項(xiàng)，表明二級(jí)結(jié)構(gòu)能值較小，基本可以接受。 引物評(píng)價(jià)完畢后，可以選擇File－Print，打印為PDF文件保存，文件中將會(huì)包括所有Oligo軟件中已經(jīng)打開(kāi)的窗口所包括的信息，多達(dá)數(shù)頁(yè)。因此，打印前最好關(guān)掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析窗口（若存在可疑的異常的話）和PCR窗口。 引物確定后，在可能情況下可對(duì)上游和下游引物分別進(jìn)行Blast分析，一般來(lái)說(shuō)，多少都會(huì)找到一些其他基因的同源序列，此時(shí)只要沒(méi)有交叉的其他基因的同源序列就可以；如果進(jìn)行全CDS（待表達(dá)DNA）的擴(kuò)增，由于PCR起點(diǎn)和終點(diǎn)是基本固定的，所以引物設(shè)計(jì)通常是沒(méi)有什么可選余地的。 |
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來(lái)自： Nolan John > 《我的圖書(shū)館》
