生物型原子力顯微鏡

它主要由帶針尖的微懸臂、微懸臂運(yùn)動(dòng)檢測(cè)裝置、監(jiān)控其運(yùn)動(dòng)的反饋回路、使樣品進(jìn)行掃描的壓電陶瓷掃描器件、計(jì)算機(jī)控制的圖像采集、顯示及處理系統(tǒng)組成。微懸臂運(yùn)動(dòng)可用如隧道電流檢測(cè)等電學(xué)方法或光束偏轉(zhuǎn)法、干涉法等光學(xué)方法檢測(cè)，當(dāng)針尖與樣品充分接近相互之間存在短程相互斥力時(shí)，檢測(cè)該斥力可獲得表面原子級(jí)分辨圖像，一般情況下分辨率也在納米級(jí)水平。AFM測(cè)量對(duì)樣品無(wú)特殊要求，可測(cè)量固體表面、吸附體系等。

　　原子力顯微鏡（atomic force microscope，簡(jiǎn)稱AFM）利用微懸臂感受和放大懸臂上尖細(xì)探針與受測(cè)樣品原子之間的作用力，從而達(dá)到檢測(cè)的目的，具有原子級(jí)的分辨率。由于原子力顯微鏡既可以觀察導(dǎo)體，也可以觀察非導(dǎo)體，從而彌補(bǔ)了掃描隧道顯微鏡的不足。原子力顯微鏡是由IBM公司蘇黎世研究中心的格爾德·賓寧與斯坦福大學(xué)的Calvin Quate于一九八五年所發(fā)明的，其目的是為了使非導(dǎo)體也可以采用類似掃描探針顯微鏡（SPM）的觀測(cè)方法。原子力顯微鏡（AFM）與掃描隧道顯微鏡（STM）最大的差別在于并非利用電子隧穿效應(yīng)，而是檢測(cè)原子之間的接觸，原子鍵合，范德瓦耳斯力或卡西米爾效應(yīng)等來(lái)呈現(xiàn)樣品的表面特性。

　　圖1. 激光檢測(cè)原子力顯微鏡探針工作示意圖

原子力顯微鏡的基本原理是：將一個(gè)對(duì)微弱力極敏感的微懸臂一端固定，另一端有一微小的針尖，針尖與樣品表面輕輕接觸，由于針尖尖端原子與樣品表面原子間存在極微弱的排斥力，通過(guò)在掃描時(shí)控制這種力的恒定，帶有針尖的微懸臂將對(duì)應(yīng)于針尖與樣品表面原子間作用力的等位面而在垂直于樣品的表面方向起伏運(yùn)動(dòng)。利用光學(xué)檢測(cè)法或隧道電流檢測(cè)法，可測(cè)得微懸臂對(duì)應(yīng)于掃描各點(diǎn)的位置變化，從而可以獲得樣品表面形貌的信息。下面，我們以激光檢測(cè)原子力顯微鏡（Atomic Force Microscope Employing Laser Beam Deflection for Force Detection,Laser-AFM）——掃描探針顯微鏡家族中最常用的一種為例，來(lái)詳細(xì)說(shuō)明其工作原理。

　　如圖1所示，二極管激光器（Laser Diode）發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)光學(xué)系統(tǒng)聚焦在微懸臂（Cantilever）背面，并從微懸臂背面反射到由光電二極管構(gòu)成的光斑位置檢測(cè)器（Detector）。在樣品掃描時(shí)，由于樣品表面的原子與微懸臂探針尖端的原子間的相互作用力，微懸臂將隨樣品表面形貌而彎曲起伏，反射光束也將隨之偏移，因而，通過(guò)光電二極管檢測(cè)光斑位置的變化，就能獲得被測(cè)樣品表面形貌的信息。

　　子力顯微鏡——原理圖

在系統(tǒng)檢測(cè)成像全過(guò)程中，探針和被測(cè)樣品間的距離始終保持在納米（10e-9米）量級(jí)，距離太大不能獲得樣品表面的信息，距離太小會(huì)損傷探針和被測(cè)樣品，反饋回路(Feedback）的作用就是在工作過(guò)程中，由探針得到探針-樣品相互作用的強(qiáng)度，來(lái)改變加在樣品掃描器垂直方向的電壓，從而使樣品伸縮，調(diào)節(jié)探針和被測(cè)樣品間的距離，反過(guò)來(lái)控制探針-樣品相互作用的強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)反饋控制。因此，反饋控制是本系統(tǒng)的核心工作機(jī)制。本系統(tǒng)采用數(shù)字反饋控制回路，用戶在控制軟件的參數(shù)工具欄通過(guò)以參考電流、積分增益和比例增益幾個(gè)參數(shù)的設(shè)置來(lái)對(duì)該反饋回路的特性進(jìn)行控制。

　　原子力顯微鏡觀察到的圖像

相對(duì)于掃描電子顯微鏡，原子力顯微鏡具有許多優(yōu)點(diǎn)。不同于電子顯微鏡只能提供二維圖像，AFM提供真正的三維表面圖。同時(shí)，AFM不需要對(duì)樣品的任何特殊處理，如鍍銅或碳，這種處理對(duì)樣品會(huì)造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害。第三，電子顯微鏡需要運(yùn)行在高真空條件下，原子力顯微鏡在常壓下甚至在液體環(huán)境下都可以良好工作。這樣可以用來(lái)研究生物宏觀分子，甚至活的生物組織。

　　和掃描電子顯微鏡(SEM）相比，AFM的缺點(diǎn)在于成像范圍太小，速度慢，受探頭的影響太大。原子力顯微鏡（Atomic Force Microscope）是繼掃描隧道顯微鏡（Scanning Tunneling Microscope）之后發(fā)明的一種具有原子級(jí)高分辨的新型儀器，可以在大氣和液體環(huán)境下對(duì)各種材料和樣品進(jìn)行納米區(qū)域的物理性質(zhì)包括形貌進(jìn)行探測(cè)，或者直接進(jìn)行納米操縱；現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于半導(dǎo)體、納米功能材料、生物、化工、食品、醫(yī)藥研究和科研院所各種納米相關(guān)學(xué)科的研究實(shí)驗(yàn)等領(lǐng)域中，成為納米科學(xué)研究的基本工具。原子力顯微鏡與掃描隧道顯微鏡相比，由于能觀測(cè)非導(dǎo)電樣品，因此具有更為廣泛的適用性。當(dāng)前在科學(xué)研究和工業(yè)界廣泛使用的掃描力顯微鏡（Scanning Force Microscope），其基礎(chǔ)就是原子力顯微鏡。

　　在原子力顯微鏡（Atomic Force Microscopy，AFM）的系統(tǒng)中，可分成三個(gè)部分：力檢測(cè)部分、位置檢測(cè)部分、反饋系統(tǒng)。

　　在原子力顯微鏡（AFM）的系統(tǒng)中，所要檢測(cè)的力是原子與原子之間的范德華力。所以在本系統(tǒng)中是使用微小懸臂（cantilever）來(lái)檢測(cè)原子之間力的變化量。微懸臂通常由一個(gè)一般100~500μm長(zhǎng)和大約500nm~5μm厚的硅片或氮化硅片制成。微懸臂頂端有一個(gè)尖銳針尖，用來(lái)檢測(cè)樣品－針尖間的相互作用力。這微小懸臂有一定的規(guī)格，例如：長(zhǎng)度、寬度、彈性系數(shù)以及針尖的形狀，而這些規(guī)格的選擇是依照樣品的特性，以及操作模式的不同，而選擇不同類型的探針。

　　原子力顯微鏡

在原子力顯微鏡（AFM）的系統(tǒng)中，當(dāng)針尖與樣品之間有了交互作用之后，會(huì)使得懸臂cantilever擺動(dòng)，所以當(dāng)激光照射在微懸臂的末端時(shí)，其反射光的位置也會(huì)因?yàn)閼冶蹟[動(dòng)而有所改變，這就造成偏移量的產(chǎn)生。在整個(gè)系統(tǒng)中是依靠激光光斑位置檢測(cè)器將偏移量記錄下并轉(zhuǎn)換成電的信號(hào)，以供SPM控制器作信號(hào)處理。

　　在原子力顯微鏡（AFM）的系統(tǒng)中，將信號(hào)經(jīng)由激光檢測(cè)器取入之后，在反饋系統(tǒng)中會(huì)將此信號(hào)當(dāng)作反饋信號(hào)，作為內(nèi)部的調(diào)整信號(hào)，并驅(qū)使通常由壓電陶瓷管制作的掃描器做適當(dāng)?shù)囊苿?dòng)，以保持樣品與針尖保持一定的作用力。

　　AFM系統(tǒng)使用壓電陶瓷管制作的掃描器精確控制微小的掃描移動(dòng)。壓電陶瓷是一種性能奇特的材料，當(dāng)在壓電陶瓷對(duì)稱的兩個(gè)端面加上電壓時(shí)，壓電陶瓷會(huì)按特定的方向伸長(zhǎng)或縮短。而伸長(zhǎng)或縮短的尺寸與所加的電壓的大小成線性關(guān)系。也就是說(shuō)，可以通過(guò)改變電壓來(lái)控制壓電陶瓷的微小伸縮。通常把三個(gè)分別代表X，Y，Z方向的壓電陶瓷塊組成三角架的形狀，通過(guò)控制X，Y方向伸縮達(dá)到驅(qū)動(dòng)探針在樣品表面掃描的目的；通過(guò)控制Z方向壓電陶瓷的伸縮達(dá)到控制探針與樣品之間距離的目的。

　　原子力顯微鏡（AFM）便是結(jié)合以上三個(gè)部分來(lái)將樣品的表面特性呈現(xiàn)出來(lái)的：在原子力顯微鏡（AFM）的系統(tǒng)中，使用微小懸臂（cantilever）來(lái)感測(cè)針尖與樣品之間的相互作用，這作用力會(huì)使微懸臂擺動(dòng)，再利用激光將光照射在懸臂的末端，當(dāng)擺動(dòng)形成時(shí)，會(huì)使反射光的位置改變而造成偏移量，此時(shí)激光檢測(cè)器會(huì)記錄此偏移量，也會(huì)把此時(shí)的信號(hào)給反饋系統(tǒng)，以利于系統(tǒng)做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，最后再將樣品的表面特性以影像的方式給呈現(xiàn)出來(lái)。

　　原子力顯微鏡的工作模式是以針尖與樣品之間的作用力的形式來(lái)分類的。主要有以下3種操作模式：接觸模式（contact mode) ，非接觸模式（ non - contact mode) 和敲擊模式( tapping mode）。

　　從概念上來(lái)理解，接觸模式是AFM最直接的成像模式。正如名字所描述的那樣，AFM 在整個(gè)掃描成像過(guò)程之中，探針針尖始終與樣品表面保持緊密的接觸，而相互作用力是排斥力。掃描時(shí)，懸臂施加在針尖上的力有可能破壞試樣的表面結(jié)構(gòu)，因此力的大小范圍在10 - 10～10 - 6 N。若樣品表面柔嫩而不能承受這樣的力，便不宜選用接觸模式對(duì)樣品表面進(jìn)行成像。

　　非接觸模式探測(cè)試樣表面時(shí)懸臂在距離試樣表面上方5～10 nm 的距離處振蕩。這時(shí)，樣品與針尖之間的相互作用由范德華力控制，通常為10 - 12 N ，樣品不會(huì)被破壞，而且針尖也不會(huì)被污染，特別適合于研究柔嫩物體的表面。這種操作模式的不利之處在于要在室溫大氣環(huán)境下實(shí)現(xiàn)這種模式十分困難。因?yàn)闃悠繁砻娌豢杀苊獾貢?huì)積聚薄薄的一層水，它會(huì)在樣品與針尖之間搭起一小小的毛細(xì)橋，將針尖與表面吸在一起，從而增加尖端對(duì)表面的壓力。

　　敲擊模式介于接觸模式和非接觸模式之間，是一個(gè)雜化的概念。懸臂在試樣表面上方以其共振頻率振蕩，針尖僅僅是周期性地短暫地接觸/ 敲擊樣品表面。這就意味著針尖接觸樣品時(shí)所產(chǎn)生的側(cè)向力被明顯地減小了。因此當(dāng)檢測(cè)柔嫩的樣品時(shí)，AFM的敲擊模式是最好的選擇之一。一旦AFM開始對(duì)樣品進(jìn)行成像掃描，裝置隨即將有關(guān)數(shù)據(jù)輸入系統(tǒng)，如表面粗糙度、平均高度、峰谷峰頂之間的最大距離等，用于物體表面分析。同時(shí)，AFM 還可以完成力的測(cè)量工作，測(cè)量懸臂的彎曲程度來(lái)確定針尖與樣品之間的作用力大小。

　　接觸模式（Contact Mode）：

　　優(yōu)點(diǎn)：掃描速度快，是唯一能夠獲得“原子分辨率”圖像的AFM垂直方向上有明顯變化的質(zhì)硬樣品，有時(shí)更適于用Contact Mode掃描成像。

　　缺點(diǎn)：橫向力影響圖像質(zhì)量。在空氣中，因?yàn)闃悠繁砻嫖揭簩拥拿?xì)作用，使針尖與樣品之間的粘著力很大。橫向力與粘著力的合力導(dǎo)致圖像空間分辨率降低，而且針尖刮擦樣品會(huì)損壞軟質(zhì)樣品（如生物樣品，聚合體等）。

　　非接觸模式（Non-Contact Mode）：

　　優(yōu)點(diǎn)：沒(méi)有力作用于樣品表面。

　　缺點(diǎn)：由于針尖與樣品分離，橫向分辨率低；為了避免接觸吸附層而導(dǎo)致針尖膠粘，其掃描速度低于Tapping Mode和Contact Mode AFM。通常僅用于非常怕水的樣品，吸附液層必須薄，如果太厚，針尖會(huì)陷入液層，引起反饋不穩(wěn)，刮擦樣品。由于上述缺點(diǎn)，on-contact Mode的使用受到限制。

　　輕敲模式（Tapping Mode）：

　　優(yōu)點(diǎn)：很好的消除了橫向力的影響。降低了由吸附液層引起的力，圖像分辨率高，適于觀測(cè)軟、易碎、或膠粘性樣品，不會(huì)損傷其表面。

　　缺點(diǎn)：比Contact Mode AFM 的掃描速度慢。

　　除了上面三種常見的三種工作模式外，原子力顯微鏡還可以進(jìn)行下面的工作：

　　1、橫向力顯微鏡（LFM）

　　橫向力顯微鏡（LFM）是在原子力顯微鏡（AFM）表面形貌成像基礎(chǔ)上發(fā)展的新技術(shù)之一。工作原理與接觸模式的原子力顯微鏡相似。當(dāng)微懸臂在樣品上方掃描時(shí)，由于針尖與樣品表面的相互作用，導(dǎo)致懸臂擺動(dòng)，其擺動(dòng)的方向大致有兩個(gè)：垂直與水平方向。一般來(lái)說(shuō)，激光位置探測(cè)器所探測(cè)到的垂直方向的變化，反映的是樣品表面的形態(tài)，而在水平方向上所探測(cè)到的信號(hào)的變化，由于物質(zhì)表面材料特性的不同，其摩擦系數(shù)也不同，所以在掃描的過(guò)程中，導(dǎo)致微懸臂左右扭曲的程度也不同，檢測(cè)器根據(jù)激光束在四個(gè)象限中，（A C）-（B D）這個(gè)強(qiáng)度差值來(lái)檢測(cè)微懸臂的扭轉(zhuǎn)彎曲程度。而微懸臂的扭轉(zhuǎn)彎曲程度隨表面摩擦特性變化而增減（增加摩擦力導(dǎo)致更大的扭轉(zhuǎn)）。激光檢測(cè)器的四個(gè)象限可以實(shí)時(shí)分別測(cè)量并記錄形貌和橫向力數(shù)據(jù)。

　　2、曲線測(cè)量

　　SFM除了形貌測(cè)量之外，還能測(cè)量力對(duì)探針-樣品間距離的關(guān)系曲線Zt（Zs）。它幾乎包含了所有關(guān)于樣品和針尖間相互作用的必要信息。當(dāng)微懸臂固定端被垂直接近，然后離開樣品表面時(shí)，微懸臂和樣品間產(chǎn)生了相對(duì)移動(dòng)。而在這個(gè)過(guò)程中微懸臂自由端的探針也在接近、甚至壓入樣品表面，然后脫離，此時(shí)原子力顯微鏡（AFM）測(cè)量并記錄了探針?biāo)惺艿牧?，從而得到力曲線。Zs是樣品的移動(dòng)，Zt是微懸臂的移動(dòng)。這兩個(gè)移動(dòng)近似于垂直于樣品表面。用懸臂彈性系數(shù)c乘以Zt，可以得到力F=c·Zt。如果忽略樣品和針尖彈性變形，可以通過(guò)s=Zt-Zs給出針尖和樣品間相互作用距離s。這樣能從Zt（Zs）曲線決定出力-距離關(guān)系F（s）。這個(gè)技術(shù)可以用來(lái)測(cè)量探針尖和樣品表面間的排斥力或長(zhǎng)程吸引力，揭示定域的化學(xué)和機(jī)械性質(zhì)，像粘附力和彈力，甚至吸附分子層的厚度。如果將探針用特定分子或基團(tuán)修飾，利用力曲線分析技術(shù)就能夠給出特異結(jié)合分子間的力或鍵的強(qiáng)度，其中也包括特定分子間的膠體力以及疏水力、長(zhǎng)程引力等。

　　3、納米加工

　　掃描探針納米加工技術(shù)是納米科技的核心技術(shù)之一，其基本的原理是利用SPM的探針－樣品納米可控定位和運(yùn)動(dòng)及其相互作用對(duì)樣品進(jìn)行納米加工操縱，常用的納米加工技術(shù)包括：機(jī)械刻蝕、電致/場(chǎng)致刻蝕、浸潤(rùn)筆（Dip-Pen Nano-lithography，DNP）等。

　　原子力顯微鏡研究對(duì)象可以是有機(jī)固體、聚合物以及生物大分子等，樣品的載體選擇范圍很大，包括云母片、玻璃片、石墨、拋光硅片、二氧化硅和某些生物膜等，其中最常用的是新剝離的云母片，主要原因是其非常平整且容易處理。而拋光硅片最好要用濃硫酸與30%雙氧水的7∶3 混合液在90 ℃下煮1h。利用電性能測(cè)試時(shí)需要導(dǎo)電性能良好的載體，如石墨或鍍有金屬的基片。

　　試樣的厚度，包括試樣臺(tái)的厚度，最大為10 mm。如果試樣過(guò)重，有時(shí)會(huì)影響Scanner的動(dòng)作，請(qǐng)不要放過(guò)重的試樣。試樣的大小以不大于試樣臺(tái)的大?。ㄖ睆?0 mm）為大致的標(biāo)準(zhǔn)。稍微大一點(diǎn)也沒(méi)問(wèn)題。但是，最大值約為40 mm。如果未固定好就進(jìn)行測(cè)量可能產(chǎn)生移位。請(qǐng)固定好后再測(cè)定。

　　隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生命科學(xué)開始向定量科學(xué)方向發(fā)展。大部分實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)已經(jīng)變成生物大分子，特別是核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的關(guān)系。因?yàn)锳FM的工作范圍很寬，可以在自然狀態(tài)（空氣或者液體）下對(duì)生物醫(yī)學(xué)樣品直接進(jìn)行成像，分辨率也很高。因此，AFM已成為研究生物醫(yī)學(xué)樣品和生物大分子的重要工具之一。AFM應(yīng)用主要包括三個(gè)方面：生物細(xì)胞的表面形態(tài)觀測(cè)；生物大分子的結(jié)構(gòu)及其他性質(zhì)的觀測(cè)研究；生物分子之間力譜曲線的觀測(cè)。

　　AFM對(duì)生物細(xì)胞的表面形態(tài)觀察

　　AFM可以用來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并進(jìn)行圖像的分析。通過(guò)觀察細(xì)胞表面形態(tài)和三維結(jié)構(gòu)，可以獲得細(xì)胞的表面積、厚度、寬度和體積等的量化參數(shù)等。例如，利用AFM可以對(duì)感染病毒后的細(xì)胞表面形態(tài)的改變、造骨細(xì)胞在加入底物（鈷鉻、鈦、鈦釩等）后細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞彈性的變化、GTP對(duì)胰腺外分泌細(xì)胞囊泡高度的影響進(jìn)行研究。利用AFM還可以對(duì)自由基損傷的紅細(xì)胞膜表面精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究，直接觀察到自由基損傷，以及加女貞子保護(hù)作用后，對(duì)紅細(xì)胞膜分子形態(tài)學(xué)的影響。

　　生物大分子的結(jié)構(gòu)及其他性質(zhì)的觀測(cè)研究

　　2.1 蛋白質(zhì)

　　對(duì)于蛋白質(zhì)，AFM的出現(xiàn)極大的推動(dòng)了其研究進(jìn)展。AFM可以觀察一些常見的蛋白質(zhì)，諸如白蛋白，血紅蛋白，胰島素及分子馬達(dá)和噬菌調(diào)理素吸附在圖同固體界面上的行為，對(duì)于了解生物相溶性，體外細(xì)胞的生長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的純化，膜中毒有很大幫助。例如，Dufrene 等利用AFM 考察了吸附在高分子支撐材料表面上的膠原蛋白的組裝行為。結(jié)合X-射線光電子能譜技術(shù)和輻射標(biāo)記技術(shù)，他們提出了一個(gè)定性解釋其層狀結(jié)構(gòu)的幾何模型。AFM 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了膠原蛋白組裝有時(shí)連續(xù)，有時(shí)不連續(xù)的性質(zhì)，通過(guò)形貌圖也提供了膠原蛋白纖維狀結(jié)構(gòu)特征。Quist等利用AFM 研究了白蛋白和豬胰島素在云母基底上的吸附行為，根據(jù)AFM 圖上不同尺寸的小丘狀物質(zhì)推測(cè)，蛋白質(zhì)有時(shí)發(fā)生聚集，有時(shí)分散分布。Epand 等則利用AFM 技術(shù)研究了一類感冒病毒的紅血球凝集素，首次展示了一種膜溶原蛋白自組裝形成病毒折疊蛋白分子外域的實(shí)時(shí)過(guò)程。

　　在AFM 觀察包裹有紫膜的噬菌調(diào)理素蛋白（BR) 的研究中，AFM 儀器的改進(jìn)，檢測(cè)技術(shù)的提高和制樣技術(shù)的完善得到了集中的體現(xiàn)。在細(xì)胞中，分子馬達(dá)可以將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)闄C(jī)械運(yùn)動(dòng)，防止因?yàn)椴祭蔬\(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的細(xì)胞中具有方向性的活動(dòng)出現(xiàn)錯(cuò)誤，這些活動(dòng)包括：肌漿球蛋白，運(yùn)動(dòng)蛋白，動(dòng)力蛋白，螺旋酶，DNA 聚合酶和RNA 聚合酶等分子馬達(dá)蛋白的共同特點(diǎn)是沿著一條線性軌道執(zhí)行一些與生命活動(dòng)息息相關(guān)的功能，比如肌肉的收縮，細(xì)胞的分化過(guò)程中染色體的隔離，不同細(xì)胞間的細(xì)胞器的置換以及基因信息的解碼和復(fù)制等。由于分子馬達(dá)本身的微型化，它們?nèi)菀资芨叩臒崮芎痛蟮牟▌?dòng)的影響，了解馬達(dá)分子如何正常有序工作就成為一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。利用AFM，人們已經(jīng)知道了肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)信息和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程中肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)控功能。

　　2.2 脫氧核糖核酸(DNA)

　　AFM液相成像技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于消除了毛細(xì)作用力，針尖粘滯力，更重要的是可以在接近生理?xiàng)l件下考察DNA 的單分子行為。DNA 分子在緩沖溶液或水溶液中與基底結(jié)合不緊密，是液相AFM面臨的主要困難之一。硅烷化試劑,如3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）和陽(yáng)離子磷脂雙層修飾的云母基底固定DNA 分子，再在緩沖液中利用AFM 成像，可以解決這一難題。在氣相條件下陽(yáng)離子參與DNA的沉積已經(jīng)發(fā)展十分成熟，適于AFM 觀察。在液相條件下，APTES 修飾的云母基底較常用。目前DNA的許多構(gòu)象諸如彎曲，超螺旋，小環(huán)結(jié)構(gòu)，三鏈螺旋結(jié)構(gòu)，DNA 三通接點(diǎn)構(gòu)象，DNA 復(fù)制和重組的中間體構(gòu)象，分子開關(guān)結(jié)構(gòu)和藥物分子插入到DNA 鏈中的相互作用都廣泛地被AFM考察，獲得了許多新的理解。

　　2.3 核糖核酸( RNA)

　　AFM對(duì)RNA的研究還不是很多。結(jié)晶的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA 和單鏈病毒RNA 以及寡聚Poly (A) 的單鏈RNA 分子的AFM 圖像已經(jīng)被獲得。因?yàn)樵谟诓煌木彌_條件下，單鏈RNA 的結(jié)構(gòu)變化十分復(fù)雜，所以單鏈RNA 分子的圖像不容易采集。（利用AFM成像RNA分子需要對(duì)樣品進(jìn)行特殊和復(fù)雜的處理。Bayburt 等借鑒Ni2 固定DNA 的方法在緩沖條件下獲得了單鏈Pre-m RNA 分子的AFM 圖像。他們的做法如下： (1) 用酸處理被Ni2 修飾的云母基底以增加結(jié)合力； (2) RNA 分子在70℃退火，慢慢將其冷卻至室溫再滴加在用酸處理過(guò)的Ni2 -云母基底上。采用AFM 單分子力譜技術(shù)，在Mg2 存在的溶液中，Liphardt 等研究了形貌多變的RNA 分子的機(jī)械去折疊過(guò)程，發(fā)現(xiàn)了從發(fā)夾結(jié)構(gòu)到三螺旋連接體這些RNA 分子三級(jí)結(jié)構(gòu)的過(guò)渡態(tài)。隨后他們又利用RNA 分子證實(shí)了可逆非平衡功函和可逆平衡自由能在熱力學(xué)上的等效性。）

　　2.4 核酸與蛋白質(zhì)復(fù)合物( Nuclearacids-Protein Complex)

　　DNA 和蛋白質(zhì)分子的特定相互作用在分子生物學(xué)中起著關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)與DNA 結(jié)合的精確位點(diǎn)圖譜和不同細(xì)胞狀態(tài)下結(jié)合位點(diǎn)的測(cè)定對(duì)于了解復(fù)雜細(xì)胞體系的功能與機(jī)理，特別是基因表達(dá)的控制都十分關(guān)鍵。AFM 作為一種高度分辨達(dá)0。1 nm，寬度分辨率為2 nm 左右的表面分析技術(shù)，已廣泛地用于表征各類DNA-蛋白質(zhì)的復(fù)合物。低濕度大氣條件下，Rees 等利用AFM 在接觸模式下考察了λ2PL 啟動(dòng)子在啟動(dòng)和關(guān)閉轉(zhuǎn)錄過(guò)程中對(duì)DNA 鏈彎曲程度的影響。此外，這個(gè)小組還研究了另外一種λ2轉(zhuǎn)錄因子，Cro-蛋白對(duì)DNA 彎曲的影響。為了研究Jun 蛋白的結(jié)合是否會(huì)引起DNA 鏈的彎曲，Becker等利用AFM研究了包含一個(gè)AP21 結(jié)合位點(diǎn)的線性化質(zhì)粒DNA 與Jun 蛋白的復(fù)合物。Aizawa小組對(duì)DNA 蛋白激酶Ku 亞結(jié)構(gòu)域和雙鏈DNA斷裂的相關(guān)性進(jìn)行了研究。Kasas 等研究了大腸桿菌RNA 聚合酶（RNAP) 轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的動(dòng)態(tài)酶活性。他們的方法是在Zn2 存在的條件下，RNAP 能夠松散或緊密地與DNA 模板進(jìn)行結(jié)合，通過(guò)AFM 成像了解其動(dòng)態(tài)過(guò)程。

　　2.5 細(xì)胞( Cell)

　　AFM 不僅能夠提供超光學(xué)極限的細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖像，還能夠探測(cè)細(xì)胞的微機(jī)械特性，利用AFM 力-曲線技術(shù)甚至能夠?qū)崟r(shí)地檢測(cè)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程。利用AFM 研究細(xì)胞很少用樣品預(yù)處理，尤其是能夠在近生理?xiàng)l件下對(duì)它們進(jìn)行研究。

　　利用AFM 直接成像方法，可以對(duì)固定的活細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入研究。這些研究獲得了關(guān)于細(xì)胞器的構(gòu)造，細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架更詳細(xì)的信息。將細(xì)胞固定在基底上再進(jìn)行AFM 觀察，可以得到細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的皺褶，層狀脂肪物，微端絲和微絨毛等特征。由于細(xì)胞質(zhì)膜掩蓋了細(xì)胞內(nèi)部骨架，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展了一種仔細(xì)剝離該層膜的方法,并利用AFM 對(duì)剝離細(xì)胞膜后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。

　　AFM 在細(xì)胞研究方面的一個(gè)最重要用途是對(duì)活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，細(xì)胞間的相互作用以及細(xì)胞對(duì)其內(nèi)外干擾因素的響應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)成像目前，AFM已經(jīng)可以對(duì)外來(lái)病毒感染的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)考察。AFM還可以研究活性狀態(tài)下血小板形狀的變化情況和培養(yǎng)的胰腺細(xì)胞對(duì)淀粉消化酶的響應(yīng)情況。

　　2.6病毒( Virus)

　　早期，AFM 在生物學(xué)上的應(yīng)用主要集中在病毒研究。Kolbe 等首次研究了具有不同頭尾結(jié)構(gòu)的T4 噬菌體。Imai 及其合作者分別對(duì)煙草花葉病毒和各類噬菌體進(jìn)行了考察。煙草花葉病毒（ TMV) 或星形煙草花葉病毒（STMV) 是迄今研究得最多的病毒類型。在膠體溶液中，TMV非常類似已知的蛋白質(zhì)行為，可以采用研究蛋白質(zhì)的方法對(duì)其進(jìn)行考察。利用AFM，可以研究高度過(guò)飽和和輕微過(guò)飽和條件下TMV的二維成核生長(zhǎng)過(guò)程。AFM研究表明，當(dāng)TYMV 暴露在平衡條件下的溶液中，TYMV 晶體的（101) 面逐層向上生長(zhǎng)，晶格的結(jié)構(gòu)缺陷如空位，單粒子，位錯(cuò)和聚集等現(xiàn)象在AFM 圖上區(qū)分得十分清楚。Turner 等利用從AIDS 病毒中提取的逆轉(zhuǎn)錄酶修飾AFM橫梁，使之成為一種能檢測(cè)抑制酶的活力和篩選使AIDS 病毒失活藥物的方法。自支撐磷脂膜與感冒病毒結(jié)合作用以及缺陷位點(diǎn)結(jié)構(gòu)上底物暴露的磷脂單層效應(yīng)和水合雙層磷脂的檢測(cè)被發(fā)展成了一種新型生物傳感器，這種傳感器能夠從其它大分子中識(shí)別特定的病毒物質(zhì)。這些結(jié)果都被AFM 圖像所證實(shí)。

　　生物分子間力譜曲線的觀測(cè)

　　對(duì)生物分子表面的各種相互作用力進(jìn)行測(cè)量，是AFM的一個(gè)十分重要的功能。這對(duì)于了解生物分子的結(jié)構(gòu)和物理特性是非常有意義的。因?yàn)檫@種作用力決定兩種分子的相互吸引或者排斥，接近或者離開，化學(xué)鍵的形成或者斷裂，生物分子立體構(gòu)像的維持或者改變等等。在分子間作用力的支配下，還同時(shí)支配著生物體內(nèi)的各種生理現(xiàn)象、生化現(xiàn)象、藥物藥理現(xiàn)象，以及離子通道的開放或關(guān)閉，受體與配體的結(jié)合或去結(jié)合，酶功能的激活或抑制等等。因此，生物分子間作用力的研究，在某種意義上說(shuō)，就是對(duì)生命體功能活動(dòng)中最根本原理的研究。這也為人們理解生命原理，提供了一個(gè)新的研究手段和工具。

　　將兩種分子分別固定于AFM的基底和探針尖端上。然后使帶有一種分子的探針尖端在垂直方向上不斷地接近和離開基底上的另一種分子。這時(shí)，兩種分子間的相互作用力，就是二者間的相對(duì)距離的函數(shù)。這種力與距離間的函數(shù)關(guān)系曲線，稱之為力譜曲線。

　　利用AFM獲得的力譜曲線在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：在探測(cè)一個(gè)細(xì)胞之后，根據(jù)所遇到的阻力，AFM就會(huì)賦予一個(gè)表明細(xì)胞柔軟度的數(shù)值。研究人員發(fā)現(xiàn)，盡管正常細(xì)胞的硬度各有不同，但癌細(xì)胞比正常細(xì)胞要柔軟得多，所研究的胰腺、肺部和乳腺細(xì)胞均是如此。一些腫瘤的細(xì)胞可能比另外一些更為堅(jiān)硬，那就意味著這些腫瘤惡化轉(zhuǎn)移的可能性較小，對(duì)病人的威脅也較小。利用AFM還可以研究不同藥物對(duì)癌細(xì)胞的影響。針對(duì)細(xì)胞用藥后，AFM可以觀察在藥物的作用下細(xì)胞的變化情況。這樣可以開發(fā)出比當(dāng)前所用的藥物毒性更小、但同樣能夠阻止正常細(xì)胞發(fā)生癌變的藥物，以免因癌癥擴(kuò)散而危及生命。