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緒 論 1、植物組織培養(yǎng)：是指在無(wú)菌和人工控制的環(huán)境條件下，利用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，對(duì)離體的植物器官、組織、細(xì)胞及原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，使其再生細(xì)胞或完整植株的技術(shù)。又稱為植物離體培養(yǎng)。 2、無(wú)菌：是指使培養(yǎng)皿、器械、培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料等處于無(wú)真菌、細(xì)菌、病毒等微生物的狀態(tài)，以保證培養(yǎng)材料在培養(yǎng)器皿中正常生長(zhǎng)發(fā)育。 3、外植體：植物組織培養(yǎng)中，使用的各種器官、組織和細(xì)胞統(tǒng)稱為外植體。 4、愈傷組織：是指外植體因受傷或在離體培養(yǎng)時(shí)，其未分化的細(xì)胞和已分化的細(xì)胞進(jìn)行活躍的分裂增殖而形成的一種無(wú)特定結(jié)構(gòu)和功能的組織。 5、組織培養(yǎng)的特點(diǎn) （1）整個(gè)過(guò)程無(wú)菌 （2）多數(shù)利用成分完全確定的人工培養(yǎng)基，植物材料處于異養(yǎng) （3）培養(yǎng)材料可以是器官、組織、細(xì)胞，處于離體狀態(tài)，在不同水平表現(xiàn)細(xì)胞全能性 （4）可形成克隆，或達(dá)到其他目的 （5）在封閉容器中進(jìn)行 （6）環(huán)境溫度、光照都是人為設(shè)定 6、組織培養(yǎng)的研究類型 （1）組織培養(yǎng) （2）器官培養(yǎng) （3）胚胎培養(yǎng) （4）細(xì)胞培養(yǎng) （5）原生質(zhì)體培養(yǎng) 7、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用 n 植物離體繁殖 n 無(wú)病毒苗木培育 n 培育新品種或創(chuàng)制新物種 n 次生代謝物生產(chǎn) n 植物種質(zhì)資源的離體保存 n 人工種子 8、植物組織培養(yǎng)的形成與發(fā)展
第一章 實(shí)驗(yàn)室及基本操作 1、常用的滅菌方法 n 高壓蒸汽滅菌 n 干熱滅菌 n 化學(xué)藥劑滅菌 n 紫外燈滅菌 n 過(guò)濾除菌 2、高壓蒸汽滅菌法
3、無(wú)菌操作
4、培養(yǎng)基的構(gòu)成 （1）水分 （2）無(wú)機(jī)鹽類 l 鐵鹽 （3）有機(jī)營(yíng)養(yǎng)（糖、維生素、氨基酸） （4）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 l 生長(zhǎng)素：IAA IBA NAA 2,4-D l 細(xì)胞分裂素：KT ZT 6-BA TDZ 2-ip （5）天然有機(jī)添加物 （6）pH（5.0-6.0） （7）凝固劑（瓊脂） 5、培養(yǎng)基的基本類型 （1）含鹽量較高的培養(yǎng)基：其代表是MS培養(yǎng)基。無(wú)機(jī)鹽濃度高，特別是硝酸鹽、鉀離子和銨離子含量豐富；元素平衡較好，緩沖性能好；微量元素和有機(jī)成分含量齊全且較豐富。 （2）硝酸鉀含量較高培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的鹽濃度高，銨態(tài)氮含量較低，但鹽酸硫胺素和硝酸鉀含量較高。 （3）中等無(wú)機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基：大量元素含量約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類少但含量較高，維生素種類較多。 （4）低無(wú)機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基：無(wú)機(jī)鹽含量非常低，為MS培養(yǎng)基的1/4左右，有機(jī)成分也很低。 6、培養(yǎng)基配制
7、外植體的選擇原則
8、常用的滅菌藥劑 酒精 次氯酸鈉 氯化汞 9、植物材料滅菌的一般過(guò)程 （1）材料前處理 （2）滅菌劑配制 （3）材料滅菌 10、培養(yǎng)條件 （1）光照
（2）溫度 一般控制在25±2℃恒溫條件下培養(yǎng)。 （3）濕度 組織培養(yǎng)室內(nèi)的相對(duì)濕度，保持在70-80% 第二章 植物組織培養(yǎng)的基本原理 1、植物細(xì)胞全能性 每一個(gè)植物細(xì)胞都帶有該植物的全部遺傳信息，在適當(dāng)條件下可表達(dá)出該細(xì)胞的所有遺傳信息，分化出植物有機(jī)體所有不同類型的細(xì)胞，形成不同類型的器官甚至胚狀體，直至形成完整再生植株。 2、細(xì)胞分化 是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在的發(fā)育方式改變的過(guò)程。 3、脫分化 也稱去分化，是指離體培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞、組織或器官經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂或不分裂逐漸失去原來(lái)的結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)分手狀態(tài)，形成無(wú)組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)或成為未分化細(xì)胞特性的細(xì)胞的過(guò)程。 4、再分化 離體培養(yǎng)的周五細(xì)胞和組織可以由脫分化狀態(tài)重新進(jìn)行分化，形成另一種或幾種類型的細(xì)胞、組織、器官，甚至形成完整植株，這個(gè)過(guò)程稱為再分化。 5、利用離體培養(yǎng)技術(shù)已揭示的細(xì)胞分化的規(guī)律和機(jī)理。 （1）細(xì)胞分化基本分為形態(tài)結(jié)構(gòu)分化和生理生化分化 （2）發(fā)育植物中不存在部分基因組永遠(yuǎn)關(guān)閉的情況 （3）在完整植株中，細(xì)胞發(fā)育途徑一旦被“決定”，通常不易改變，但離體培養(yǎng)可以通過(guò)脫分化而喪失“決定” （4）極性與分化關(guān)系密切 （5）生殖隔離或機(jī)械隔離在細(xì)胞分化中的促進(jìn)作用 （6）細(xì)胞分裂對(duì)細(xì)胞分化具有重要作用 （7）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在細(xì)胞分化中有明顯的調(diào)節(jié)作用 （8）細(xì)胞核染色體和DNA的變化對(duì)細(xì)胞分化的作用 6、再生植株的途徑 器官發(fā)生和胚胎發(fā)生 7、影響細(xì)胞脫分化的因素 （1）損傷 （2）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 （3）光照 （4）細(xì)胞位置 （5）外植體的生理狀態(tài) （6）植物種類差異 8、愈傷組織形成 （1）誘導(dǎo)期 （2）分裂期 （3）分化期 9、愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程發(fā)生的生理生化變化 （1）RNA先增加后減少 （2）同工酶譜發(fā)生變化 （3）連續(xù)繼代培養(yǎng)可能改變次生物質(zhì)的積累水平或能力 （4）可能出現(xiàn)馴化現(xiàn)象 10、胚狀體 在離體培養(yǎng)條件下，植物離體培養(yǎng)的細(xì)胞、組織、器官也可以產(chǎn)生類似胚的結(jié)構(gòu)，其形成也經(jīng)歷一個(gè)類似胚胎的發(fā)生和發(fā)育過(guò)程，這種類似胚的結(jié)構(gòu)稱為胚狀體。 11、體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程 原胚 球形胚 心形胚 魚(yú)雷形胚 成熟胚 12、植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的生理生化變化 （1）蛋白質(zhì)和核酸 （2）多胺代謝 （3）糖類、金屬離子和微量元素 （4）內(nèi)源激素 （5）活性氧 13、影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素 （1）植物種類和基因型 （2）培養(yǎng)材料的生理狀態(tài) ① 植株的發(fā)育年齡 ② 培養(yǎng)器官或組織類型 ③ 培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)胞倍性 （3）培養(yǎng)基 ①植物營(yíng)養(yǎng) ②植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 ③物理性質(zhì) （4）培養(yǎng)條件 ①光（光照強(qiáng)度、光照長(zhǎng)度、光質(zhì)） ②溫度 第三章 植物器官和組織培養(yǎng) 1、植物器官培養(yǎng) 是指對(duì)植物某一器官的全部或部分或器官原基進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。 2、植物器官和組織培養(yǎng)的基本程序 （1）無(wú)菌外植體的獲得 ①莖尖、莖段、葉片的滅菌 ②根、塊莖、鱗莖的滅菌 ③花蕾的滅菌 ④果實(shí)、種子的滅菌 （2）初代培養(yǎng)物的建立無(wú)菌環(huán)境 ①規(guī)范操作 ②條件合適 （3）形態(tài)發(fā)生和植株再生 （4）培養(yǎng)產(chǎn)物的觀察記載 ①愈傷組織 ②胚狀體 ③芽 ④根 3、莖段培養(yǎng)獲得產(chǎn)物 l 單苗（芽） l 叢生苗（芽） l 完整植物 l 愈傷組織 4、葉培養(yǎng)獲得產(chǎn)物 l 不定芽或胚狀體 l 愈傷組織 l 成熟葉 5、條件化效應(yīng) 從離體培養(yǎng)的植物上取得的外植體已具有了被促進(jìn)的形態(tài)發(fā)生能力。 6、花器官培養(yǎng)獲得產(chǎn)物 l 成熟果實(shí) l 不定芽或叢生芽 l 愈傷組織 7、種子培養(yǎng)獲得產(chǎn)物 l 小植株 l 愈傷組織 l 叢生芽或不定芽 8、莖尖培養(yǎng) 是指對(duì)植物頂端的原分生組織和它衍生的分生組織的培養(yǎng)。莖尖培養(yǎng)的材料可以是10-100um的莖尖分生組織，也可以是幾十毫米的莖尖或更大的芽。 9、植物分生組織培養(yǎng) 是指對(duì)植物的分生組織進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)，包括植物根尖、莖尖等頂端分生組織和形成層組織的培養(yǎng)。 10、莖尖培養(yǎng)獲得產(chǎn)物 l 芽萌發(fā) l 產(chǎn)生胚狀體 l 產(chǎn)生不定器官 l 形成愈傷組織 11、莖尖離體培養(yǎng)后可能的培養(yǎng)反應(yīng) ①生長(zhǎng)太慢 ②生長(zhǎng)過(guò)旺 ③生長(zhǎng)正常 第四章 植物胚胎培養(yǎng)及離體授粉 1、胚培養(yǎng)的類型 幼胚、成熟胚 2、胚培養(yǎng)的應(yīng)用 ①克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性 ②打破種子休眠，縮短育種周期 ③提高種子萌發(fā)率 3、胚珠培養(yǎng)的意義 ①使雜種盡早培養(yǎng)，防止雜胚早期敗育，獲得雜種植株 ②通過(guò)受精前胚珠培養(yǎng)以及未受精的胎座或子房培養(yǎng)，可以作為試管受精的基礎(chǔ) ③未受精的胚珠培養(yǎng)能和花藥培養(yǎng)一樣，誘導(dǎo)出大孢子或卵細(xì)胞增殖，形成單倍體，用于單倍體育種 4、子房培養(yǎng)的意義 ①使未受精胚囊中的單倍性細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)育成單倍體植株 ②獲得雜種植株 ③為試管受精提供一項(xiàng)基礎(chǔ)技術(shù) 5、離體授粉 是指將未授粉的胚珠或子房從母體上分離下來(lái)，進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，并以一定的方式授以無(wú)菌花粉，使之在試管內(nèi)實(shí)現(xiàn)受精的技術(shù)，又稱為離體受精或試管受精。 6、離體授粉的程序 （1）確定開(kāi)花、花藥開(kāi)裂、授粉、花粉管進(jìn)入胚珠和受精的時(shí)間 （2）去雄后將花蕾套袋隔離 （3）制備無(wú)菌子房或胚珠 （4）制備無(wú)菌花粉 （5）胚珠（或子房）的試管內(nèi)受精 第五章 植物花藥和花粉培養(yǎng) 1、花藥和花粉培養(yǎng)的概念 l 誘導(dǎo)花粉細(xì)胞發(fā)育成單倍體植株 l 花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)的范疇 l 花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)的范疇 l 花粉培養(yǎng)具有一定優(yōu)越性 2、花粉和花藥培養(yǎng)的應(yīng)用 （1）作物育種 （2）物種進(jìn)化研究 （3）遺傳分析 （4）分子生物學(xué) （5）植物基因克隆篩選 3、雄核發(fā)育途徑 （1）A途徑 ① A-V途徑 ② A-G途徑 ③ A-VG途徑 ④ C途徑 （2）B途徑 4、花粉分離方法 （1）自然散落發(fā) （2）擠壓法 ① 擠壓法 ② 研磨過(guò)濾收集法 （3）機(jī)械游離法 ① 磁攪拌法 ② 小型攪拌法 5、花粉培養(yǎng)方式 l 平板培養(yǎng) l 看護(hù)培養(yǎng) l 液體培養(yǎng) l 雙層培養(yǎng) l 微室培養(yǎng) l 條件培養(yǎng)基培養(yǎng) 6、影響雄核發(fā)育的影響因素 （1）基因型 （2）植株生長(zhǎng)條件和生理狀態(tài) （3）花粉發(fā)育時(shí)期 ①花粉粒發(fā)育時(shí)期的觀察 ②花粉發(fā)育時(shí)期的確定 （4）預(yù)處理 ①高低溫處理 ②化學(xué)物質(zhì)處理 a高糖 b甘露醇 c秋水仙素 d乙烯利 ③其他 a γ射線 b離心 c磁場(chǎng) （5）培養(yǎng)基 ①基本培養(yǎng)基 ②碳源 ③氨基酸和其他有機(jī)物質(zhì) ④植物激素 ⑤活性炭 ⑥pH （6）培養(yǎng)條件 ①溫度 ②光照 ③植板密度 （7）花藥壁因素 7、花粉和花藥植株的倍性鑒定 （1）染色體直接計(jì)數(shù)法 （2）間接鑒定 ① 掃描細(xì)胞光度儀鑒定 ② 細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法 ③ 植物形態(tài)學(xué)鑒定法 ④ 高/低溫脅迫法 ⑤ 雜交鑒定法 ⑥ 分子標(biāo)記鑒定法 8、花粉和花藥植株的染色體加倍 ①莖段培養(yǎng) ②化學(xué)試劑誘變 a秋水仙素誘導(dǎo) b除草劑誘導(dǎo) 第六章 植物細(xì)胞培養(yǎng) 1、單細(xì)胞培養(yǎng) 就是對(duì)分離得到的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分裂增殖，形成細(xì)胞團(tuán)，再通過(guò)細(xì)胞分化形成芽、根等器官或胚狀體，直至長(zhǎng)成完整植株的技術(shù)。 2、人工種子 又稱合成種子，一般是指離體培養(yǎng)條件下的植物材料，通過(guò)繁殖獲得大量的高質(zhì)量的成熟胚狀體，把這些胚狀體外面包上有機(jī)化合物作為保護(hù)胚狀體及提供營(yíng)養(yǎng)的“種皮”，從而創(chuàng)造出與真種子類似的結(jié)構(gòu)。 3、分批培養(yǎng) 是指把細(xì)胞分散在一定容積的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)物增殖到一定量時(shí)，轉(zhuǎn)接繼代，建立起單細(xì)胞培養(yǎng)物。 4、單細(xì)胞培養(yǎng)方法 （1）平板培養(yǎng) （2）看護(hù)培養(yǎng) （3）微室培養(yǎng) （4）條件培養(yǎng)基培養(yǎng) 5、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方法 （1）分批培養(yǎng) 延滯期 對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期 直線生長(zhǎng)期 緩慢期 靜止期 （2）半連續(xù)培養(yǎng) （3）連續(xù)培養(yǎng) l 封閉型連續(xù)培養(yǎng) l 開(kāi)放型連續(xù)培養(yǎng)（濁度恒定、化學(xué)恒定） 6、懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定 l 細(xì)胞計(jì)數(shù) l 細(xì)胞總體積及細(xì)胞密實(shí)體積 l 細(xì)胞鮮重和干重 l 細(xì)胞有絲分裂指數(shù) l 細(xì)胞植板率 7、人工種子的優(yōu)點(diǎn) （1）使自然條件下不易結(jié)實(shí)或種子昂貴的材料能夠快速繁殖和保存 （2）繁殖速度快 （3）固定雜種優(yōu)勢(shì)，可使F1雜種優(yōu)勢(shì)多代利用 （4）為基因工程技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)提供橋梁 （5）在人工種子的制作中，加入各種營(yíng)養(yǎng)成分或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)，提高植物抗性 （6）在一定程度上可取代天然種子而節(jié)約糧食，貯運(yùn)方便，可播種育苗 第七章 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)及細(xì)胞融合 1、原生質(zhì)體融合 是指通過(guò)物理或化學(xué)方法使原生質(zhì)體融合，經(jīng)培養(yǎng)獲得具有雙親全部（或部分）遺傳物質(zhì)的后代的方法，亦稱體細(xì)胞雜交。 2、細(xì)胞質(zhì)工程 又稱細(xì)胞拆合工程，是通過(guò)物理或化學(xué)方法將細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分開(kāi)，再進(jìn)行不同細(xì)胞間核、質(zhì)的重新組合，重建成新細(xì)胞。 3、微原生質(zhì)體融合技術(shù) 又稱微核技術(shù)，是指以植物細(xì)胞經(jīng)微核化處理后形成的、外包有被膜、內(nèi)含一條或幾條染色體的微核作為供體，與受體原生質(zhì)體融合，從而實(shí)現(xiàn)部分基因組轉(zhuǎn)移的技術(shù)。 4、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素 （1）供試材料 （2）酶的種類、組合和酶解時(shí)間 （3）滲透壓穩(wěn)定劑 （4）質(zhì)膜穩(wěn)定劑 （5）pH 5、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法 （1）平板培養(yǎng)法 優(yōu)點(diǎn)：原生質(zhì)體分布均勻，有利于分裂；容易獲得單細(xì)胞株系；可定位觀察單個(gè)原生質(zhì)體的生長(zhǎng)發(fā)育情況 缺點(diǎn)：原生質(zhì)體易受熱傷害；易破碎；原生質(zhì)體始終處在高滲透壓脅迫下，生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，植板率低 （2）液體淺層培養(yǎng)法 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，對(duì)原生質(zhì)體傷害小；可微量培養(yǎng)；能及時(shí)降低滲透壓并補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞植板率高 缺點(diǎn)：原生質(zhì)體沉淀，分布不均勻；形成的細(xì)胞團(tuán)聚集在一起，難以選出單細(xì)胞無(wú)性系 （3）固-液結(jié)合培養(yǎng)法 優(yōu)點(diǎn)：原生質(zhì)體分布均勻，有利于分裂；容易獲得單細(xì)胞株系；因能除去抑制分裂的有害物質(zhì)，細(xì)胞植板率高 缺點(diǎn)：原生質(zhì)體易受熱傷害；易破碎 6、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素 （1）原生質(zhì)體活力 （2）原生質(zhì)體起始密度 （3）滲透壓穩(wěn)定劑 （4）培養(yǎng)基成分 ①基本培養(yǎng)基 ②碳源 ③無(wú)機(jī)鹽濃度和氮的形態(tài) ④植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度配比 （5）培養(yǎng)條件 （6）植物材料和基因型 7、原生質(zhì)體融合類型 l 對(duì)稱融合 l 不對(duì)稱融合 l 微原生質(zhì)體融合 8、融合產(chǎn)物的類型 l 異核體 l 多核體 l 同核體 l 異胞質(zhì)體 9、電融合法的操作過(guò)程 （1）制備原生質(zhì)體 （2）調(diào)整融合參數(shù)，設(shè)定好電場(chǎng)強(qiáng)度高頻信號(hào)、處理時(shí)間等 （3）融合處理，等量混合原生質(zhì)體，滴入融合槽內(nèi)，施加高壓脈沖，使原生質(zhì)體發(fā)生極化、排列、膜穿孔、閉合、融合 （4）離心洗滌 （5）融合體培養(yǎng) 10、融合體的發(fā)育過(guò)程 l 細(xì)胞壁再生 l 核融合 l 細(xì)胞增殖 11、雜種細(xì)胞選擇 （1）互補(bǔ)篩選法 ①激素自養(yǎng)型互補(bǔ)選擇 ②白化互補(bǔ)選擇 ③營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)選擇 ④抗性突變體互補(bǔ)選擇 ⑤基因互補(bǔ)選擇 （2）機(jī)械篩選法 ①天然顏色標(biāo)記分離 ②熒光素標(biāo)記分離 ③熒光活性自動(dòng)細(xì)胞分類器分類融合體 12、雜種植株的選擇 l 形態(tài)學(xué)鑒定 l 細(xì)胞學(xué)鑒定 l 生物化學(xué)鑒定 l 分子生物學(xué)鑒定 第八章 植物體細(xì)胞無(wú)性系變異 1、體細(xì)胞無(wú)性系變異 是指培養(yǎng)物在培養(yǎng)階段發(fā)生變異，進(jìn)而導(dǎo)致再生植株亦發(fā)生遺傳改變的現(xiàn)象。 2、外遺傳變異 也稱發(fā)育變異，即由于外部影響導(dǎo)致基因表達(dá)的改變，從而引起表型上的變異。 3、體細(xì)胞變異的特點(diǎn) （1）優(yōu)點(diǎn) ①適用于各種可進(jìn)行組織培養(yǎng)的作物 ②持續(xù)快速提供變異源 ③消除優(yōu)良品種的一個(gè)或幾個(gè)缺陷 ④提供新型變異株系 （2）缺點(diǎn) ①繼代培養(yǎng)多次后，植株再生能力減弱 ②一些變異經(jīng)自交或雜交后表現(xiàn)不穩(wěn)定 ③變異沒(méi)有可預(yù)見(jiàn)性，會(huì)產(chǎn)生一些不符合育種需要的變異 4、影響體細(xì)胞無(wú)性系變異的因素 （1）外植體 （2）物種和基因型 （3）培養(yǎng)基 ①基本培養(yǎng)基 ②植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 （4）繼代培養(yǎng)時(shí)間 5、植物體細(xì)胞無(wú)性系變異的機(jī)理 （1）預(yù)先存在的變異表達(dá) （2）染色體數(shù)目變化 （3）點(diǎn)突變 （4）體細(xì)胞染色體交換及姐妹染色單體交換 （5）DNA復(fù)制和缺失 （6）轉(zhuǎn)座因子的活化 （7）DNA甲基化 （8）胞質(zhì)DNA的變化 （9）外遺傳變異 第九章 植物離體繁殖 1、植物離體繁殖 又稱植物快繁或微繁，是指利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其短期內(nèi)獲得遺傳性一致的大量再生植株的方法。 2、褐化 是指培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料逐漸變褐而死亡的現(xiàn)象。 3、污染：是指在組培過(guò)程中，由于真菌、細(xì)菌等微生物污染，在培養(yǎng)容器中滋生大量菌斑，使培養(yǎng)材料不能正常生長(zhǎng)和發(fā)育的現(xiàn)象。 4、玻璃化：是試管苗的一種生理失調(diào)癥狀，表現(xiàn)為試管苗葉片、嫩梢呈水浸透明或半透明狀。 5、植物快繁特點(diǎn) （1）繁殖效率高 （2）培養(yǎng)條件可控性強(qiáng) （3）占用空間小 （4）管理方便 （5）便于種質(zhì)保存和交換 6、植物快繁的器官形成方式 l 短枝發(fā)生型 l 叢生芽發(fā)生型（最普遍） l 不定芽發(fā)生型 l 胚狀體發(fā)生型（速度最快） l 原球莖發(fā)生型（蘭科植物） 7、植物快繁的程序 （1）階段I 無(wú)菌培養(yǎng)的建立 ①母株和外植體的選取 ②無(wú)菌培養(yǎng)物的獲得 ③外植體的啟動(dòng)生長(zhǎng) （2）階段II 繁殖體增殖 ①培養(yǎng)材料的增殖 ②增殖培養(yǎng)基 ③增殖體的大小和切割方法 （3）階段III 芽苗生根 ①離體生根 ②活體生根 （4）階段IV 小植株的移栽馴化 ①移栽 ②馴化管理 8、影響植物快繁的因素 （1）外植體 ①外植體的來(lái)源 ②外植體生理年齡 ③外植體大小 （2）培養(yǎng)基 ①基本培養(yǎng)基 ②植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 ③培養(yǎng)基的物理特性 （3）培養(yǎng)條件 ①光照 ②溫度 ③濕度 ④氣體 （4）繼代培養(yǎng) （5）移栽 ①根系結(jié)構(gòu) ②葉表皮組織 9、試管苗的根系結(jié)構(gòu) （1）不生根，可采用嫁接法解決 （2）根與輸導(dǎo)系統(tǒng)不連接，可將芽切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，重新誘導(dǎo)根的形成 （3）根無(wú)根毛或很少，將小苗移栽前置入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，有時(shí)可促進(jìn)根毛發(fā)育 （4）根無(wú)吸收功能或極低，移栽前將試管苗在培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間，可恢復(fù)根的吸收功能 10、試管苗的葉組織特征 ①葉表角質(zhì)層和蠟質(zhì)層不發(fā)達(dá)或無(wú) ②葉無(wú)表皮毛或極少 ③葉解剖結(jié)構(gòu)稀疏 ④氣孔開(kāi)張大，不關(guān)閉 ⑤葉片存在排水孔 ⑥光合作用能力極低 11、試管苗商業(yè)化生產(chǎn)成本 ①人工費(fèi)用 ②生產(chǎn)物資費(fèi)用 ③設(shè)備折舊費(fèi)用 ④水電費(fèi)用 ⑤其他費(fèi)用 12、降低商業(yè)化成本的措施 ①提高勞動(dòng)生產(chǎn)率 ②減少設(shè)備投資，延長(zhǎng)使用壽命 ③降低消耗 ④降低污染，提高繁殖率和成活率 ⑤簡(jiǎn)化培養(yǎng)基 13、污染 （1）原因 ①培養(yǎng)基及各種接種器皿滅菌不徹底 ②外植體滅菌不徹底 ③操作時(shí)人為帶入 ④環(huán)境不清潔 ⑤超凈工作區(qū)不清潔 （2）控制措施 ①滅菌前充分排盡滅菌鍋內(nèi)冷空氣，滅菌溫度121-126℃，滅菌時(shí)間20-30min ②接種器具每次使用后應(yīng)用酒精灼燒 ③污染的外植體應(yīng)及時(shí)淘汰，如果種源有限可進(jìn)行二次消毒 ④操作人員接種時(shí)應(yīng)用75%酒精擦拭雙手和培養(yǎng)瓶表面，操作區(qū)內(nèi)不要放入過(guò)多待用培養(yǎng)瓶 ⑤接種環(huán)境定期用福爾馬林等熏蒸滅菌，經(jīng)常用紫外燈滅菌 ⑥超凈工作臺(tái)應(yīng)定期對(duì)初濾器清洗和更換，提前15-20 min打開(kāi)，并用75%酒精擦拭整個(gè)工作臺(tái) 14、遺傳穩(wěn)定性 （1）影響因素 ①基因型 ②繼代次數(shù) ③器官發(fā)生方式 （2）降低變異措施 ①選用不易發(fā)生遺傳變異的基因型材料 ②縮短繼代時(shí)間，限制繼代次數(shù) ③采用不易發(fā)生遺傳變異的增殖途徑 ④采用適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑物質(zhì)和較低的濃度，減少或不使用易引起誘變的物質(zhì)，及時(shí)剔除生理和形態(tài)異常苗 15、玻璃化 （1）原因 ①培養(yǎng)基的瓊脂和蔗糖濃度 ②培養(yǎng)溫度 ③生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度 ④培養(yǎng)瓶中乙烯濃度 ⑤光照 ⑥培養(yǎng)基含氮量 （2）防止措施 ①提高培養(yǎng)基硬度，降低培養(yǎng)基水勢(shì) ②提高培養(yǎng)基中蔗糖含量或加入滲透劑，降低培養(yǎng)基滲透壓 ③利用可透氣性瓶塞材料，降低培養(yǎng)瓶中過(guò)高過(guò)飽和濕度 ④減少培養(yǎng)基中含氮化合物、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的用量 ⑤增加光照強(qiáng)度，適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度，并進(jìn)行晝夜變溫處理 ⑥一些添加物或抗生素可減少或防止玻璃化發(fā)生 16、褐化 （1）原因 ①植物種類和品種 ②外植體年齡、大小和取材時(shí)間 ③外植體損傷 ④光照 ⑤溫度 ⑥培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng) ⑦培養(yǎng)基成分 （2）防止措施 ①在冬春季節(jié)選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w，即外植體應(yīng)具有較強(qiáng)分生能力 ②選擇適宜的培養(yǎng)基，調(diào)整激素用量 ③控制溫度和光照 ④培養(yǎng)基中添加抗氧化劑和其他抑制劑或吸附劑 ⑤加快繼代轉(zhuǎn)瓶速度 17、黃化 （1）影響因素 ①培養(yǎng)基成分 ②培養(yǎng)條件 ③pH ④抗生素類 （2）控制措施 ①檢查培養(yǎng)基配制過(guò)程，保證培養(yǎng)基成分正確添加 ②調(diào)節(jié)培養(yǎng)基組成和pH ③控制培養(yǎng)室溫度，增加光照，改善瓶?jī)?nèi)通氣情況 ④減少或不用抗生素物質(zhì) 第十章 無(wú)病毒苗培育 1、植物脫病毒的機(jī)理 （1）植物病毒自身不具有主動(dòng)轉(zhuǎn)移到能力，無(wú)論在病田植株間還是在病組織內(nèi)，病毒的移動(dòng)都是被動(dòng)的 （2）在旺盛分裂的細(xì)胞中，代謝活性很高，使病毒無(wú)法復(fù)制 （3）在植物體內(nèi)可能存在著病毒鈍化系統(tǒng)，在分生組織中比其他任何區(qū)域具有更高的活性 （4）莖尖中存在高水平內(nèi)源激素，可抑制病毒增殖 2、植物脫毒方法 （1）物理方法：熱水或熱空氣處理 （2）化學(xué)方法 （3）生物學(xué)方法 ①莖尖組織培養(yǎng)脫毒法 ②愈傷組織培養(yǎng)脫毒法 ③微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒法 ④珠心組織培養(yǎng)脫毒法 （4）綜合脫毒法 ①莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理脫毒法 ②莖尖培養(yǎng)結(jié)合病毒鈍化劑處理脫毒法 3、脫病毒植株的檢測(cè) l 直接測(cè)定法 l 指示植物法 l 血清鑒定法（酶聯(lián)免疫吸附法） l 核酸分析法 l 電鏡鑒定法 4、脫病毒植株保存 l 在溫室或防蟲(chóng)罩內(nèi) l 大規(guī)模繁育生產(chǎn)用種，可在田間隔離區(qū)進(jìn)行 l 簽定脫毒苗的遺傳穩(wěn)定性 5、脫病毒植株的繁殖和應(yīng)用 （1）繁殖 ①脫病毒植株繼代培養(yǎng)快繁 ②快繁苗的生根及微型鱗莖（或微型小薯、原球莖）的培養(yǎng) （2）應(yīng)用 ①研究特定病毒對(duì)寄主植物的影響 ②用于種質(zhì)材料的保存和良種生產(chǎn) · 脫毒苗的培育 · 原原種的生產(chǎn) · 一級(jí)原種生產(chǎn) · 二級(jí)原種生產(chǎn) · 一級(jí)種薯生產(chǎn) · 二級(jí)種薯生產(chǎn) 第十一章 植物種質(zhì)資源離體保存 1、種質(zhì)資源離體保存 是指對(duì)離體培養(yǎng)的小植株、器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等材料，采用限制、延緩或停止其生長(zhǎng)的處理使之保存，在需要時(shí)可重新恢復(fù)其生長(zhǎng)，并再生植株的方法。 2、種子保存的局限性 ①種子生活力隨貯存期的延長(zhǎng)會(huì)逐漸喪失 ②無(wú)性繁殖的植物難于采用種子保存 ③采用無(wú)性繁殖來(lái)保持性狀的植物，用種子繁殖后代會(huì)發(fā)生變異 ④頑拗型種子植物不宜用種子保存或保存難度大 ⑤易遭受自然災(zāi)害襲擊而丟失 3、離體種質(zhì)保存的特點(diǎn) （1）優(yōu)點(diǎn) ①占用空間少，節(jié)約大量的人力、物力和土地 ②便于種質(zhì)資源的交流利用 ③需要時(shí)，可以用離體培養(yǎng)方法很快大量繁殖 ④避免自然災(zāi)害引起的種質(zhì)丟失 （2）缺點(diǎn) ①對(duì)于限制或延緩生長(zhǎng)的處理，需定期轉(zhuǎn)移，連續(xù)繼代培養(yǎng) ②易受微生物污染或發(fā)生人為差錯(cuò) ③多次繼代培養(yǎng)有可能造成遺傳變異及材料的分化和再生能力的逐漸喪失 4、限制生長(zhǎng)保存 （1）低溫保存法 （2）高滲透壓保存法 （3）生長(zhǎng)抑制劑（或延緩劑）保存法 （4）降低氧分壓保存法 （5）干燥保存法 5、超低溫保存的基本原理和操作程序 （1）基本原理 （2）操作程序 ①植物材料（培養(yǎng)物）的選取 ②材料預(yù)處理 ③冷凍處理 慢凍法 快凍法 預(yù)凍法 干凍法 ④冷凍貯存 ⑤解凍 a快速解凍 b慢速解凍 ⑥再培養(yǎng) |
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