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翻譯自：From RNA-seq reads to differential expression, Oshlack et al. Genome Biology 2010, 11:220 高通量測序技術(shù)，也就是下一代測序技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)研究的一個較為常規(guī)的實驗手段了。這一技術(shù)的發(fā)展極大地推動了基因組學(xué)，表觀基因組學(xué)以及翻譯組學(xué)的研究。RNA-seq通過測定穩(wěn)定狀態(tài)下的RNA樣品的序列來對RNA樣品進行研究，從而避免了許多之前研究手段的不足，比如象基因芯片或者PCR就需要背景知識。而且RNA-seq還可以觸及以前無法研究的領(lǐng)域，比如復(fù)雜結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄體。RNA-seq可以應(yīng)用于以下幾個方面的研究，1. SNPs；2. novel transcripts；3. alternative splicing；4. RNA editing。無論如何，使用RNA-seq最多的還是比較兩組樣品基因水平表達差異，比如野生型與突變型，用藥組與對照組，不同組織之間，癌細胞與正常細胞，等等。我們把這種基因水平差異表達，簡稱為DE (differential expression，注，不是ED啊???)。 常用的RNA-seq操作平臺有Illumina GA/ HiSeq, SOLiD 還有Roche 454。它們都是提取RNA后，純化，打碎，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后測序。測序的結(jié)果被稱為short reads，短序。通常一個短序的長度為25-300bp之間。如果測序只測一端可能會帶來比對時的困難，于是這些操作平臺提供了兩端都測的辦法，這樣的結(jié)果成對出現(xiàn)，中間有一定的間隔，但是因為測序長度一下子提高了一倍，所以比對會精準(zhǔn)很多。人們把這種測序結(jié)果稱為’paired-end’ reads，成對短序。一般來講，測序結(jié)果會直接轉(zhuǎn)換成一行一行的由字母組成的短序列，可能是fasta,fastq等等不同格式。 然而，這一技術(shù)產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)分析卻給生物學(xué)家?guī)砹穗y題。一個測序的結(jié)果文件少則幾Gb，多則幾十Gb，單獨對比拼接，就會用去幾個小時，而后再得出差異表達的結(jié)果，其耗時耗力，并非實驗生物學(xué)家可以應(yīng)付得了的。于是生物信息學(xué)的研究人員努力做出一些軟件，以降低結(jié)果分析的難度。但是，即使這樣，還是必須對分析過程有個較為細致地了解，才能正確地使用這些軟件，從而得到比較接近事實的結(jié)果。 一般的來講，RNA-seq后DE的工作流程是這樣的（圖1），首先，將短序映射到基因組相應(yīng)的位置上去，其次，對映射的結(jié)果進行基因水平，外顯子水平，以及轉(zhuǎn)錄水平的拼接，而后對結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，標(biāo)準(zhǔn)化之后生成表達水平報告文件，最后由生物學(xué)者依據(jù)系統(tǒng)生物學(xué)相關(guān)知識，來對數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析。  RNA-seq分析工作流程 不同步驟涉汲的軟件和方法：
映射至基因組（Mapping）第一步的工作是比對(alignment)。對于RNA-seq的比對，從來都不是一件容易的事情。其難點如下：
為了解決最后一個問題，人們使用了很多辦法，但基本上都會基于事先建立的引索庫。即所謂“啟發(fā)式”比對(heuristic match)。首先使用一定長度的（通常是11個堿基）的序列做為索引用的關(guān)鍵字，在匹配這一索引字之后，就很大程度地縮小了其需要匹配的模板范圍。但是這一辦法的問題在于不容易解決問題2中的空格，錯配問題。所以在很多軟件使用時，會要求人工確認(rèn)高保真區(qū)，以及最高允許2?3個錯配。 現(xiàn)在比較快的“啟發(fā)式”比對主要有兩種算法，一種是哈希表(hash table)，一種是BW壓縮轉(zhuǎn)換(Burrows Wheeler transform, BWT)。前者速度快，但是對內(nèi)存要求比后者要高。 對于問題3，一般而言，大部分軟件使用的辦法是只保留一個匹配位點，其中，有些是只保留第一個匹配位點，有些是按照概率分布選取保留的位點。當(dāng)然，前面已經(jīng)提到過，可以使用paired-end read來盡量避免問題3的出現(xiàn)。 對于問題1，可以使用外顯子庫來確定junction reads。有兩種辦法，一種是依靠已知的外顯子庫來構(gòu)建，另一種辦法就是依據(jù)已經(jīng)匹配好的短序來構(gòu)建外顯子庫(de novo assembly of transcriptome)。后者的不足是運算量大，對測序覆蓋范圍要求高，最好是使用paired-end reads。 還有人發(fā)現(xiàn)，對于ploy(A)的處理會減少不能映身的短序數(shù)。比如，Pickrell et al.就發(fā)現(xiàn)，對于46bp的Illumina reads，87％的短序可以映射至模板，7％可以映射至junction library。如果對那些不能映射的短序，將在頭或者尾含有的超過連續(xù)4個的A或者T去除，就可以得到約0.005%的映射。 綜合評價（Summarizing mapped reads）這一步，主要是基本于不同水平（外顯子水平，轉(zhuǎn)錄水平，或者基因水平）進行統(tǒng)計。最簡單的辦法就是統(tǒng)計落在每個外顯上的短序數(shù)。但是有研究表明，很多（可能超過15％）的短序會落在外顯子兩側(cè)，這會影響統(tǒng)計的結(jié)果。另一種辦法就是統(tǒng)會落在內(nèi)顯子區(qū)域的短序數(shù)。 無論如何，即使是基因水平的綜合評價，也還是有其它的一些問題。比如overlapping的基因的統(tǒng)計。比如junction的統(tǒng)計。 標(biāo)準(zhǔn)化（Normalization）標(biāo)準(zhǔn)化對于樣品內(nèi)及樣品間的比較而言是非常重要的。標(biāo)準(zhǔn)化被分為兩類，樣品內(nèi)及樣品間（between- and within-library）。 樣品內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化使得在同一樣品內(nèi)不得基因之間的表達差異變得有意義。最常用到的一個辦法就是使用落在同一基因內(nèi)的短序數(shù)除以單位基因長度。比較常用的單位是RPKM (reads per kilobase of exon model per million mapped reads)。但是這一方法也受到樣品制備和測序方法的干擾。 而對于樣品間標(biāo)準(zhǔn)化，最簡單而直接的辦法使用短序總數(shù)來平衡表達量。然而短序總數(shù)受測序深度的干擾，而且單個基因的短序數(shù)與實際的表達量并不一定會呈線性比較關(guān)系。人們又使用四分位(quantile normlization)標(biāo)準(zhǔn)化的辦法。但是有研究說這一辦法并沒有實際的價值。還有提出使用對數(shù)分布法則(power law distributions)來進行樣品間標(biāo)準(zhǔn)化。但沒有研究對這一處理方式進行驗證。 差異表達（Differential expression）差異表達分析的最終目的是將那些差異表達的基因（外顯子等等）從海量數(shù)據(jù)中提取出來。最終的結(jié)果顯示一般來說是表格化的，這一表格按照一定的規(guī)則排序，讓人們能夠盡可能簡單地拿到想要的結(jié)果。 由于RNA-seq結(jié)果的離散性，人們一般都會使用統(tǒng)計模型來擬合實驗得到的結(jié)果。一般而言，RNA-seq的結(jié)果是比較附合伯松分布(poisson distribution)的。這一結(jié)果得到了單通道Illumina GA測序結(jié)果的實驗驗證。但是，伯松分布分析結(jié)果常常在多組重復(fù)的樣品間帶來較高的假陽性，因為它低估了生物取樣的樣品間誤差。所以RNA-seq如何設(shè)置重復(fù)是一個很重要的問題。為了平衡重復(fù)樣品所帶來的誤差，人們使用了serial analysis of gene expression (SAGE) data。 現(xiàn)有的軟件一般都是針對較為簡單的實驗設(shè)計的。而對于復(fù)雜的實驗設(shè)計，比如說成對樣品，時間依賴樣品等等，還沒有專門的，較好的解決方案。大多數(shù)都使用edgeR的線性模型來進行分析。 后期系統(tǒng)生物學(xué)分析簡單地講，前景是廣闊的，但目前為止手段還是比較有限的，基本上就是GO分析。 |
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