作者: holyala (站內(nèi)聯(lián)系TA)    發(fā)布: 2011-04-18

今天看到一個帖子討論第二代測序，可惜回帖寥寥。在基因組學(xué)研究如火如荼的年代，就算不做測序，了解一下這項(xiàng)技術(shù)也是不錯的。竊以為在不遠(yuǎn)的將來，個人基因組應(yīng)用必將廣泛開展，而第二代或第三代測序技術(shù)正是這一領(lǐng)域的主角。不才在這一領(lǐng)域也混了小兩年，多少有些了解，今天特發(fā)此專題，希望能給大家?guī)硪稽c(diǎn)有意思的東西。
--------------------------------------分割線---以下正文--------------------------------------

第二代測序技術(shù)（Next-Generation Sequencing）
NGS之基礎(chǔ)篇
    2001年，美、英、法、德、日、中六國合作，歷時(shí)十年，耗資數(shù)十億美元的人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project，HGP）宣告完成。轉(zhuǎn)眼又是十年過去，在此期間，各國科學(xué)家仍在為解讀基因的密碼而不懈努力，這其中最大的突破，就是第二代測序技術(shù)的推出。HGP的順利完成證明了我們有能力對自身的遺傳信息進(jìn)行研究，然而，高昂的成本、漫長的時(shí)間、巨大的人力需求，無不限制著對遺傳密碼的進(jìn)一步認(rèn)識。從HGP開始的第一天期，科學(xué)家們就在尋求更好的方法來對基因組進(jìn)行研究，“鳥槍法”就是其中之一。2006年，美國X大獎基金會（www.xprize.org）設(shè)立了獎金高達(dá)1000萬美元的基因組Archon X大獎，旨在獎勵第一個在10天內(nèi)以低于100萬美元的成本完成100個人類基因組測序的民間團(tuán)隊(duì)。而羅氏（Roche）、應(yīng)用生物系統(tǒng)（Applied Biosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量測序平臺，成為NGS領(lǐng)域的領(lǐng)頭羊。
    2005年底，454公司推出第一個基于焦磷酸測序原理的高通量基因組測序系統(tǒng)——Genome Sequencer 20 System，這是核酸測序技術(shù)發(fā)展史上里程碑式的事件。隨后，羅氏公司以1.55億美元收購了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX測序系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在10小時(shí)的運(yùn)行中獲得100萬條讀長（reads），4~6億個堿基信息（base pair），且準(zhǔn)確率達(dá)到99%以上。2008年，GS FLX系統(tǒng)再次升級，通量提高了5倍，讀長和準(zhǔn)確率也有所增加。雖然454 GS測序平臺也許不是市場占有率最高的測序儀，但截至2011年3月，利用該系統(tǒng)進(jìn)行研究的論文已發(fā)表超過1000余篇，而它在讀長上的優(yōu)勢明顯勝于另兩套系統(tǒng)，因此在從頭測序（de novo）和宏基因組測序（meta genome）方面有著不可替代的地位。
    2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系統(tǒng)——Genome Analyzer，簡稱GA。這套基于DNA簇（DNA cluster）、橋式PCR（Bridge PCR）和可逆阻斷（Reversible terminator）等核心技術(shù)的系統(tǒng)具有高通量、低錯誤率、低成本、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。2007年，Illumina公司以6億美元的高價(jià)收購了Solexa，使GA得以商品化。GA最早期的版本一次運(yùn)行可獲得1Gb的數(shù)據(jù)，因此也有1Gb Analyzer的含義，而最新的Hiseq2000平臺則能夠在10天的運(yùn)行中獲得300Gb以上的數(shù)據(jù)，讀取的堿基長度達(dá)到150bp左右。更有消息稱，Illumina已完成了600Gb的運(yùn)行測試并在部分客戶中開展了前期體驗(yàn)，Tb（1000Gb）級的測試Run也將于年內(nèi)進(jìn)行。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，Illumina公司已售出超過600臺/套GA IIx和Hiseq2000平臺，2010年僅深圳華大基因研究院一家就購買了128臺Hiseq2000，一舉成為全球最大的基因組測序與分析中心，Illumina公司在測序領(lǐng)域的影響力由此可見一斑。
    在Sanger測序時(shí)代，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）一直是該行業(yè)的龍頭老大，其壟斷地位無人能撼，從早期的377到全自動化的3730xl，ABI的測序儀被廣泛應(yīng)用在基因組學(xué)研究的各個方面。然而在第二代測序技術(shù)迅猛發(fā)展之初，ABI起步較晚，顯得有些漫不經(jīng)心。直到2005年454公司推出GS平臺，ABI的領(lǐng)先地位受到威脅，這才開始發(fā)力，迅速收購了研發(fā)NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD測序平臺。此后SOLiD不斷升級，目前已到SOLiD 5版本（SOLiD 5500xl）。SOLiD的全稱是Sequencing by Oligo Ligation Detection，即寡聚物連接檢測測序，其基本原理是通過熒光標(biāo)記的8堿基單鏈DNA探針與模板配對連接，發(fā)出不同的熒光信號，從而讀取目標(biāo)序列的堿基排列順序。在該方法下，目標(biāo)序列的所有堿基都被讀取了兩遍，因此SOLiD最大的優(yōu)勢就是它的高準(zhǔn)確率。據(jù)悉，SOLiD 5平臺的測序通量已達(dá)到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，準(zhǔn)確率高達(dá)99.99%。并且由于SOLiD系統(tǒng)采用的不是PCR反應(yīng)進(jìn)行DNA合成與測序，因此對于高GC含量的樣本，SOLiD系統(tǒng)具有非常大的優(yōu)勢。
宣傳視頻：
454
沒找到
Solexa
http://www./Media/flash_player.ilmn?dirname=systems&swfname=GA_workflow_vid&width=780&height=485&iframe
SOLiD
http://media.invitrogen.com./ab/applications-technologies/solid/solid-5500.html
今天繼續(xù)，454測序詳解。
NGS之進(jìn)階篇
    454的焦磷酸測序原理，簡單來說就是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用，將PCR反應(yīng)每一個堿基（dNTP）的延伸與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過記錄熒光信號的有無和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測定DNA序列的目的。在454測序儀中，A、T、G、C四種堿基是分別存儲在單獨(dú)的試劑瓶中的，每步反應(yīng)四種堿基依次加入反應(yīng)池，當(dāng)堿基配對結(jié)合，就會釋放出一個焦磷酸（PPi），而這個焦磷酸在酶的作用下，將熒光素氧化成氧化熒光素，并發(fā)出光信號，從而讀取出這一位置的堿基信息。
    454測序儀的整個實(shí)驗(yàn)步驟可大致概括為：樣品處理、文庫制備、emPCR、反應(yīng)板準(zhǔn)備、上機(jī)測序。樣品處理主要是針對大片段的DNA分子，如基因組DNA、Fosmid或BAC質(zhì)粒等，利用超聲或氮?dú)獯驍鄬⑦@些DNA分子片段化，然后采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化，選擇500-800bp的DNA片段。對于非編碼RNA或PCR產(chǎn)物，則不需要這一步驟。文庫制備包括接頭連接和磁珠純化兩步，454的文庫接頭分A、B兩種，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的測序引物及4bp（TCAG）的“key”堿基構(gòu)成，其中B接頭的5’端帶有生物素（Biotin）標(biāo)記，用于磁珠純化步驟。經(jīng)過磁珠結(jié)合與DNA變性之后，只有A+目的片段+B形式的連接產(chǎn)物得以富集，另兩種形式（AA、BB）的產(chǎn)物都被去除。emPCR是454測序的一個關(guān)鍵步驟，將富集到的文庫與測序磁珠、各反應(yīng)物混合，加入特定的礦物油和表面活性劑，再利用振蕩器劇烈振蕩，使反應(yīng)體系形成油包水（water-in-oil）的穩(wěn)定乳濁液。在理想條件下，每一個液滴，或稱微反應(yīng)器（microreactor）中將只包含一個磁珠和一條單鏈DNA，通過控制該步驟的條件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方個理想的微反應(yīng)器。經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，每一個磁珠上將形成密集的DNA簇，這些DNA序列完全相同，即可用于后續(xù)的步驟。454測序的反應(yīng)板稱為PTP（Pico Titer Plate），含有350萬個由光纖組成的小孔，每個孔的直徑為29μm，而測序磁珠的直徑為20μm，因此每個孔中僅能容納一個磁珠。將磁珠與測序試劑加入PTP中，使之可用于上機(jī)測序。測序步驟如前所述，四種堿基在泵的控制下依次加入反應(yīng)板，反應(yīng)完成后再洗去，每延伸一個或若干個堿基，就會發(fā)出一次光信號，通過記錄信號的有無和強(qiáng)度，即可測定DNA序列。
    454測序準(zhǔn)確度較高，當(dāng)讀長超過400bp時(shí)，其準(zhǔn)確性仍能達(dá)到99%以上，主要的錯誤來自于同聚物，即相同堿基的連續(xù)延伸，如ATTTG這樣一段序列，A和G的讀取沒有問題，但T只記錄了一次光信號，僅信號強(qiáng)度與ATG序列的T有所不同，因此同聚物越長，可能產(chǎn)生的誤差就越大。目前，由于454測序儀在讀長上的明顯優(yōu)勢，它在大基因組從頭測序（de novo）、轉(zhuǎn)錄組分析、基因組結(jié)構(gòu)分析等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
   
    以下圖片：1. 454 GS FLX測序儀外觀；2. 3（4）種連接產(chǎn)物的磁珠純化；3. PTP板與測序磁珠；4. 454 GS測序峰圖；5. 上機(jī)準(zhǔn)備實(shí)拍圖。

NGS之進(jìn)階篇二：Solexa
    Illumina Solexa高通量測序平臺可以說是目前“測序界”應(yīng)用最廣泛的NGS平臺，它在兼容性、操作性和成本方面有著較大的優(yōu)勢，第一個亞洲人基因組“炎黃一號”、第一個非洲人基因組、熊貓基因組、家蠶基因組甲基化圖譜等等，都是在該平臺的支持下完成的。從最初的GA到GA IIx，又更新?lián)Q代為現(xiàn)在的Hiseq2000，Solexa測序平臺的通量由1Gb/run一路提升至300Gb/run，預(yù)計(jì)在年內(nèi)還將實(shí)現(xiàn)1Tb/run的升級，測序讀長也從幾十bp提高到150bp。當(dāng)年的人類基因組計(jì)劃用了10年時(shí)間完成了一個基因組的精細(xì)圖，而現(xiàn)在使用Hiseq2000測序儀只需10天左右的時(shí)間，即可完成至少3個人類全基因組的測序工作，NGS測序能力的飛速發(fā)展甚至超過了IT屆的摩爾定律。
    與454一樣，Solexa測序平臺所采用的也是SBS（Sequencing-by-Synthesis，邊合成邊測序）的方式，并且也利用光信號收集信息。有所不同的是，Solexa并沒有采用間接反應(yīng)（焦磷酸氧化熒光素）的形式激發(fā)光信號，而是直接在dNTP上連接熒光基團(tuán)和阻斷基團(tuán)，通過“去阻斷—延伸—激發(fā)熒光—切割熒光基團(tuán)—去阻斷”這樣一個循環(huán)的方法來依次讀取目的DNA上的堿基排列順序。如下圖所示，該原理在基礎(chǔ)篇的Solexa宣傳視頻中亦有提及。由于采用了可逆阻斷技術(shù)（即在dNTP上連接可剪切的阻斷基團(tuán)），Solexa測序的每一步只延伸一個堿基，不會出現(xiàn)類似于454測序的同聚物影響準(zhǔn)確性的問題，因此其單堿基準(zhǔn)確性較高，但隨著讀長的增加，熒光信號會有所衰弱，所以越“靠后”的堿基準(zhǔn)確性會逐漸降低，這也是Solexa測序讀長受限的一個主要因素。

    Solexa平臺的應(yīng)用范圍極廣，幾乎囊括了目前基因組學(xué)研究的所有方面，例如基因組從頭測序（de novo）、重測序（re-sequencing）、基因組結(jié)構(gòu)分析、轉(zhuǎn)錄組測序、表達(dá)譜分析、小RNA及非編碼RNA測序、表觀遺傳學(xué)研究等等。然而，應(yīng)用該平臺的核心過程是大致相同的，這也為它的兼容性提供了很大的便利。Solexa測序的實(shí)驗(yàn)流程主要包括：樣品處理、文庫制備、芯片準(zhǔn)備及上級測序。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠穪碓吹牟煌琒olexa測序的樣品處理也有所不同，基因組DNA需進(jìn)行打斷及片段選擇，total RNA需富集mRNA或小RNA，mRNA也要進(jìn)行片段化處理，ChIP（染色質(zhì)免疫共沉淀）、甲基化及PCR產(chǎn)物等都有各自的處理方式，需要實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)情況進(jìn)行選擇。以基因組DNA測序?yàn)槔?，在獲得樣本后，首先需要對DNA進(jìn)行檢測，保證樣本的濃度和完整性符合實(shí)驗(yàn)要求，然后使用超聲或氮?dú)獯驍?，將這些DNA分子片段化，這步與454的樣品處理類似，但不需要收集特定范圍的DNA片段即可用于下一步實(shí)驗(yàn)。文庫制備過程可分為末端修復(fù)、3’端腺苷化、接頭連接、片段選擇、PCR擴(kuò)增以及文庫純化六個步驟。末端修復(fù)是將片段化的DNA分子在幾種酶的作用下，補(bǔ)齊隨機(jī)打斷造成的黏性末端而成為平末端。3’腺苷化目的是在DNA雙鏈的3’端加上dATP，以便于下一步的接頭連接。Solexa文庫制備所用的接頭（adapter）是一個一端互補(bǔ)，另一端開叉Y字形DNA片段，互補(bǔ)的部分5’端有一個T，可與3’腺苷化的DNA進(jìn)行T-A連接，開叉的部分則是為了通過PCR擴(kuò)增引入測序引物P5和P7的互補(bǔ)序列。接頭連接完成后，再采用采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化獲得特定大小的片段（通常為目的片段大小+120bp），如構(gòu)建200bp文庫，則回收320±20bp的DNA。之后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增和純化，即得到可用與上機(jī)測序的文庫。此時(shí)的文庫DNA由待測序列、測序接頭、引物互補(bǔ)序列及index標(biāo)簽序列（如非index文庫則無），如下圖所示。

    芯片準(zhǔn)備與上機(jī)測序主要由機(jī)器完成，在此不做贅述，若想做進(jìn)一步了解，可訪問Illumina官方網(wǎng)站的技術(shù)支持：http://www./technology/sequencing_technology.ilmn。
    同樣，最后獻(xiàn)上幾張圖片：1. cBot芯片制備儀與Hiseq2000測序儀；2. Solexa GAII測序芯片；3. Solexa測序光信號采集直觀圖；4. Solexa測序流程與原理示意圖。

--------------------------------------分割線---以下正文--------------------------------------

第二代測序技術(shù)（Next-Generation Sequencing）
NGS之基礎(chǔ)篇
    2001年，美、英、法、德、日、中六國合作，歷時(shí)十年，耗資數(shù)十億美元的人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project，HGP）宣告完成。轉(zhuǎn)眼又是十年過去，在此期間，各國科學(xué)家仍在為解讀基因的密碼而不懈努力，這其中最大的突破，就是第二代測序技術(shù)的推出。HGP的順利完成證明了我們有能力對自身的遺傳信息進(jìn)行研究，然而，高昂的成本、漫長的時(shí)間、巨大的人力需求，無不限制著對遺傳密碼的進(jìn)一步認(rèn)識。從HGP開始的第一天期，科學(xué)家們就在尋求更好的方法來對基因組進(jìn)行研究，“鳥槍法”就是其中之一。2006年，美國X大獎基金會（www.xprize.org）設(shè)立了獎金高達(dá)1000萬美元的基因組Archon X大獎，旨在獎勵第一個在10天內(nèi)以低于100萬美元的成本完成100個人類基因組測序的民間團(tuán)隊(duì)。而羅氏（Roche）、應(yīng)用生物系統(tǒng)（Applied Biosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量測序平臺，成為NGS領(lǐng)域的領(lǐng)頭羊。
    2005年底，454公司推出第一個基于焦磷酸測序原理的高通量基因組測序系統(tǒng)——Genome Sequencer 20 System，這是核酸測序技術(shù)發(fā)展史上里程碑式的事件。隨后，羅氏公司以1.55億美元收購了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX測序系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在10小時(shí)的運(yùn)行中獲得100萬條讀長（reads），4~6億個堿基信息（base pair），且準(zhǔn)確率達(dá)到99%以上。2008年，GS FLX系統(tǒng)再次升級，通量提高了5倍，讀長和準(zhǔn)確率也有所增加。雖然454 GS測序平臺也許不是市場占有率最高的測序儀，但截至2011年3月，利用該系統(tǒng)進(jìn)行研究的論文已發(fā)表超過1000余篇，而它在讀長上的優(yōu)勢明顯勝于另兩套系統(tǒng)，因此在從頭測序（de novo）和宏基因組測序（meta genome）方面有著不可替代的地位。
    2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系統(tǒng)——Genome Analyzer，簡稱GA。這套基于DNA簇（DNA cluster）、橋式PCR（Bridge PCR）和可逆阻斷（Reversible terminator）等核心技術(shù)的系統(tǒng)具有高通量、低錯誤率、低成本、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。2007年，Illumina公司以6億美元的高價(jià)收購了Solexa，使GA得以商品化。GA最早期的版本一次運(yùn)行可獲得1Gb的數(shù)據(jù)，因此也有1Gb Analyzer的含義，而最新的Hiseq2000平臺則能夠在10天的運(yùn)行中獲得300Gb以上的數(shù)據(jù)，讀取的堿基長度達(dá)到150bp左右。更有消息稱，Illumina已完成了600Gb的運(yùn)行測試并在部分客戶中開展了前期體驗(yàn)，Tb（1000Gb）級的測試Run也將于年內(nèi)進(jìn)行。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，Illumina公司已售出超過600臺/套GA IIx和Hiseq2000平臺，2010年僅深圳華大基因研究院一家就購買了128臺Hiseq2000，一舉成為全球最大的基因組測序與分析中心，Illumina公司在測序領(lǐng)域的影響力由此可見一斑。
    在Sanger測序時(shí)代，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）一直是該行業(yè)的龍頭老大，其壟斷地位無人能撼，從早期的377到全自動化的3730xl，ABI的測序儀被廣泛應(yīng)用在基因組學(xué)研究的各個方面。然而在第二代測序技術(shù)迅猛發(fā)展之初，ABI起步較晚，顯得有些漫不經(jīng)心。直到2005年454公司推出GS平臺，ABI的領(lǐng)先地位受到威脅，這才開始發(fā)力，迅速收購了研發(fā)NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD測序平臺。此后SOLiD不斷升級，目前已到SOLiD 5版本（SOLiD 5500xl）。SOLiD的全稱是Sequencing by Oligo Ligation Detection，即寡聚物連接檢測測序，其基本原理是通過熒光標(biāo)記的8堿基單鏈DNA探針與模板配對連接，發(fā)出不同的熒光信號，從而讀取目標(biāo)序列的堿基排列順序。在該方法下，目標(biāo)序列的所有堿基都被讀取了兩遍，因此SOLiD最大的優(yōu)勢就是它的高準(zhǔn)確率。據(jù)悉，SOLiD 5平臺的測序通量已達(dá)到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，準(zhǔn)確率高達(dá)99.99%。并且由于SOLiD系統(tǒng)采用的不是PCR反應(yīng)進(jìn)行DNA合成與測序，因此對于高GC含量的樣本，SOLiD系統(tǒng)具有非常大的優(yōu)勢。
宣傳視頻：
454
沒找到
Solexa
http://www./Media/flash_player.ilmn?dirname=systems&swfname=GA_workflow_vid&width=780&height=485&iframe
SOLiD
http://media.invitrogen.com./ab/applications-technologies/solid/solid-5500.html
今天繼續(xù)，454測序詳解。
NGS之進(jìn)階篇
    454的焦磷酸測序原理，簡單來說就是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用，將PCR反應(yīng)每一個堿基（dNTP）的延伸與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過記錄熒光信號的有無和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測定DNA序列的目的。在454測序儀中，A、T、G、C四種堿基是分別存儲在單獨(dú)的試劑瓶中的，每步反應(yīng)四種堿基依次加入反應(yīng)池，當(dāng)堿基配對結(jié)合，就會釋放出一個焦磷酸（PPi），而這個焦磷酸在酶的作用下，將熒光素氧化成氧化熒光素，并發(fā)出光信號，從而讀取出這一位置的堿基信息。
    454測序儀的整個實(shí)驗(yàn)步驟可大致概括為：樣品處理、文庫制備、emPCR、反應(yīng)板準(zhǔn)備、上機(jī)測序。樣品處理主要是針對大片段的DNA分子，如基因組DNA、Fosmid或BAC質(zhì)粒等，利用超聲或氮?dú)獯驍鄬⑦@些DNA分子片段化，然后采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化，選擇500-800bp的DNA片段。對于非編碼RNA或PCR產(chǎn)物，則不需要這一步驟。文庫制備包括接頭連接和磁珠純化兩步，454的文庫接頭分A、B兩種，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的測序引物及4bp（TCAG）的“key”堿基構(gòu)成，其中B接頭的5’端帶有生物素（Biotin）標(biāo)記，用于磁珠純化步驟。經(jīng)過磁珠結(jié)合與DNA變性之后，只有A+目的片段+B形式的連接產(chǎn)物得以富集，另兩種形式（AA、BB）的產(chǎn)物都被去除。emPCR是454測序的一個關(guān)鍵步驟，將富集到的文庫與測序磁珠、各反應(yīng)物混合，加入特定的礦物油和表面活性劑，再利用振蕩器劇烈振蕩，使反應(yīng)體系形成油包水（water-in-oil）的穩(wěn)定乳濁液。在理想條件下，每一個液滴，或稱微反應(yīng)器（microreactor）中將只包含一個磁珠和一條單鏈DNA，通過控制該步驟的條件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方個理想的微反應(yīng)器。經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，每一個磁珠上將形成密集的DNA簇，這些DNA序列完全相同，即可用于后續(xù)的步驟。454測序的反應(yīng)板稱為PTP（Pico Titer Plate），含有350萬個由光纖組成的小孔，每個孔的直徑為29μm，而測序磁珠的直徑為20μm，因此每個孔中僅能容納一個磁珠。將磁珠與測序試劑加入PTP中，使之可用于上機(jī)測序。測序步驟如前所述，四種堿基在泵的控制下依次加入反應(yīng)板，反應(yīng)完成后再洗去，每延伸一個或若干個堿基，就會發(fā)出一次光信號，通過記錄信號的有無和強(qiáng)度，即可測定DNA序列。
    454測序準(zhǔn)確度較高，當(dāng)讀長超過400bp時(shí)，其準(zhǔn)確性仍能達(dá)到99%以上，主要的錯誤來自于同聚物，即相同堿基的連續(xù)延伸，如ATTTG這樣一段序列，A和G的讀取沒有問題，但T只記錄了一次光信號，僅信號強(qiáng)度與ATG序列的T有所不同，因此同聚物越長，可能產(chǎn)生的誤差就越大。目前，由于454測序儀在讀長上的明顯優(yōu)勢，它在大基因組從頭測序（de novo）、轉(zhuǎn)錄組分析、基因組結(jié)構(gòu)分析等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
   
    以下圖片：1. 454 GS FLX測序儀外觀；2. 3（4）種連接產(chǎn)物的磁珠純化；3. PTP板與測序磁珠；4. 454 GS測序峰圖；5. 上機(jī)準(zhǔn)備實(shí)拍圖。

NGS之進(jìn)階篇二：Solexa
    Illumina Solexa高通量測序平臺可以說是目前“測序界”應(yīng)用最廣泛的NGS平臺，它在兼容性、操作性和成本方面有著較大的優(yōu)勢，第一個亞洲人基因組“炎黃一號”、第一個非洲人基因組、熊貓基因組、家蠶基因組甲基化圖譜等等，都是在該平臺的支持下完成的。從最初的GA到GA IIx，又更新?lián)Q代為現(xiàn)在的Hiseq2000，Solexa測序平臺的通量由1Gb/run一路提升至300Gb/run，預(yù)計(jì)在年內(nèi)還將實(shí)現(xiàn)1Tb/run的升級，測序讀長也從幾十bp提高到150bp。當(dāng)年的人類基因組計(jì)劃用了10年時(shí)間完成了一個基因組的精細(xì)圖，而現(xiàn)在使用Hiseq2000測序儀只需10天左右的時(shí)間，即可完成至少3個人類全基因組的測序工作，NGS測序能力的飛速發(fā)展甚至超過了IT屆的摩爾定律。
    與454一樣，Solexa測序平臺所采用的也是SBS（Sequencing-by-Synthesis，邊合成邊測序）的方式，并且也利用光信號收集信息。有所不同的是，Solexa并沒有采用間接反應(yīng)（焦磷酸氧化熒光素）的形式激發(fā)光信號，而是直接在dNTP上連接熒光基團(tuán)和阻斷基團(tuán)，通過“去阻斷—延伸—激發(fā)熒光—切割熒光基團(tuán)—去阻斷”這樣一個循環(huán)的方法來依次讀取目的DNA上的堿基排列順序。如下圖所示，該原理在基礎(chǔ)篇的Solexa宣傳視頻中亦有提及。由于采用了可逆阻斷技術(shù)（即在dNTP上連接可剪切的阻斷基團(tuán)），Solexa測序的每一步只延伸一個堿基，不會出現(xiàn)類似于454測序的同聚物影響準(zhǔn)確性的問題，因此其單堿基準(zhǔn)確性較高，但隨著讀長的增加，熒光信號會有所衰弱，所以越“靠后”的堿基準(zhǔn)確性會逐漸降低，這也是Solexa測序讀長受限的一個主要因素。

    Solexa平臺的應(yīng)用范圍極廣，幾乎囊括了目前基因組學(xué)研究的所有方面，例如基因組從頭測序（de novo）、重測序（re-sequencing）、基因組結(jié)構(gòu)分析、轉(zhuǎn)錄組測序、表達(dá)譜分析、小RNA及非編碼RNA測序、表觀遺傳學(xué)研究等等。然而，應(yīng)用該平臺的核心過程是大致相同的，這也為它的兼容性提供了很大的便利。Solexa測序的實(shí)驗(yàn)流程主要包括：樣品處理、文庫制備、芯片準(zhǔn)備及上級測序。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠穪碓吹牟煌?，Solexa測序的樣品處理也有所不同，基因組DNA需進(jìn)行打斷及片段選擇，total RNA需富集mRNA或小RNA，mRNA也要進(jìn)行片段化處理，ChIP（染色質(zhì)免疫共沉淀）、甲基化及PCR產(chǎn)物等都有各自的處理方式，需要實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)情況進(jìn)行選擇。以基因組DNA測序?yàn)槔?，在獲得樣本后，首先需要對DNA進(jìn)行檢測，保證樣本的濃度和完整性符合實(shí)驗(yàn)要求，然后使用超聲或氮?dú)獯驍啵瑢⑦@些DNA分子片段化，這步與454的樣品處理類似，但不需要收集特定范圍的DNA片段即可用于下一步實(shí)驗(yàn)。文庫制備過程可分為末端修復(fù)、3’端腺苷化、接頭連接、片段選擇、PCR擴(kuò)增以及文庫純化六個步驟。末端修復(fù)是將片段化的DNA分子在幾種酶的作用下，補(bǔ)齊隨機(jī)打斷造成的黏性末端而成為平末端。3’腺苷化目的是在DNA雙鏈的3’端加上dATP，以便于下一步的接頭連接。Solexa文庫制備所用的接頭（adapter）是一個一端互補(bǔ)，另一端開叉Y字形DNA片段，互補(bǔ)的部分5’端有一個T，可與3’腺苷化的DNA進(jìn)行T-A連接，開叉的部分則是為了通過PCR擴(kuò)增引入測序引物P5和P7的互補(bǔ)序列。接頭連接完成后，再采用采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化獲得特定大小的片段（通常為目的片段大小+120bp），如構(gòu)建200bp文庫，則回收320±20bp的DNA。之后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增和純化，即得到可用與上機(jī)測序的文庫。此時(shí)的文庫DNA由待測序列、測序接頭、引物互補(bǔ)序列及index標(biāo)簽序列（如非index文庫則無），如下圖所示。

    芯片準(zhǔn)備與上機(jī)測序主要由機(jī)器完成，在此不做贅述，若想做進(jìn)一步了解，可訪問Illumina官方網(wǎng)站的技術(shù)支持：http://www./technology/sequencing_technology.ilmn。
    同樣，最后獻(xiàn)上幾張圖片：1. cBot芯片制備儀與Hiseq2000測序儀；2. Solexa GAII測序芯片；3. Solexa測序光信號采集直觀圖；4. Solexa測序流程與原理示意圖。