共刺激分子受體CTLA-4的研究進展及在風濕病治療中的應用

（中國醫(yī)學科學院　中國協(xié)和醫(yī)科大學　北京協(xié)和醫(yī)院　風濕免疫科北京，100730，）　田新平　曾小峰

        系統(tǒng)性風濕病是一種以自身免疫功能紊亂為發(fā)病基礎的臨床疾病，依所累及的靶器官不同臨床表現(xiàn)復雜，屬臨床疑難病。過去由于對風濕病發(fā)病機制了解不足，因此多年來治療的主要手段為糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑。隨著分子生物學研究的發(fā)展以及對風濕病發(fā)病的基因組學和病因?qū)W研究的逐漸深入，對風濕病發(fā)病中的一些重要環(huán)節(jié)也有了深入的了解，其中包括一些在免疫應答過程中起調(diào)節(jié)作用的細胞和在異常免疫應答通路中起樞紐作用的細胞因子。近幾年來，在免疫應答中起重要調(diào)節(jié)作用的細胞毒T淋巴細胞抗原-4（CTLA-4）和CTLA-4免疫球蛋白（CTLA-4Ig）成為風濕病治療中的熱點。

1．  CTLA-4

        針對外來抗原正常的獲得性免疫應答反應需要非常精細的調(diào)節(jié)才能保證機體在清除有害的外來抗原同時又不傷害到自身組織。近30年來免疫學研究的最大進展就是證實抗原遞呈細胞必須提供2種相互獨立的信號才能完全激活T淋巴細胞，其中第一信號是抗原與人主要組織相容性抗原結合后表達的T細胞表面受體；第二信號是與T細胞表達的共同活化分子受體相結合的配體；2種信號的共同作用才能達到最佳的細胞因子合成、細胞增殖。由于只有專職抗原遞呈細胞能提供共同活化信號，因此即使有自身反應性T細胞存在，在沒有共同活化信號存在時，表達自身抗原的組織細胞與T細胞的反應也不能誘導T細胞活化，產(chǎn)生自身免疫應答；其次，共同活化信號的存在為開發(fā)一些通過阻斷共同活化信號達到自身免疫耐受的藥物提供了理論依據(jù)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，對外來抗原的免疫反應質(zhì)量和反應程度是由活化性（正性）共同活化信號和抑制性（負性）共同活化信號的共同作用決定的，其中CD28和CTLA-4是通過這種活化性和抑制性共同活化信號調(diào)節(jié)免疫應答的關鍵受體[1]。

        CD28和CTLA-4是2種具有同源性的免疫球蛋白超家族成員，僅在專職抗原遞呈細胞表面表達，二者與相同的配體CD86(B7-2)和CD80(B7-1)結合。CD86在樹突細胞、巨噬細胞和B細胞表面表達，在這些細胞被激活后表達明顯增強，而CD80僅在激活的抗原遞呈細胞表面表達，因此二者與免疫應答的啟動有關，在T細胞的活化中具有不同的功能。CD28可以使細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄分子積聚、IL-2表達明顯上調(diào)最終誘導T細胞增殖，因此CD28是T細胞活化的正性信號，而CTLA-4是T細胞活化的重要下調(diào)節(jié)因子。在T細胞活化后4h，CTLA-4就與一些特異抗體交鏈并在一些T淋巴細胞表面表達，抑制T細胞的完全活化。在T細胞活化過程中，CTLA-4的主要作用是通過抑制細胞核內(nèi)IL-2基因的轉(zhuǎn)錄來抑制T細胞的活化。此外，CTLA-4還能直接抑制細胞周期的一些關鍵成分的表達從而抑制細胞的增殖[2]。大多數(shù)研究都證實，觸發(fā)CTLA-4可以下調(diào)整個T細胞群的增殖和細胞因子合成，起到抑制免疫應答的作用[3]。此外，CTLA-4還通過調(diào)節(jié)T細胞來抑制免疫應答反應[4]。

        編碼人CTLA-4的基因具有多種多態(tài)性，其中一些可以影響到一些蛋白的合成和表達。迄今為止，研究人員對CTLA-4的3種基因多態(tài)性進行了廣泛研究。位于啟動子區(qū)與基因轉(zhuǎn)錄起始相關的第-318位單核苷酸多態(tài)性（SNP，single-nucleotide polymorphism）可以影響基因的表達，此位點具有高分泌活性的等位基因T具有防止自身免疫反應和炎癥反應發(fā)生的作用。在另一位于第1外顯子第+49位的SNP編碼序列1--CDS1位點的G等位基因可以降低CTLA-4mRNA的穩(wěn)定性和T細胞表面蛋白的表達，增加機體對自身免疫性疾病和炎癥性疾病的易感性。第+49位SNP與一個位于非翻譯區(qū)（3‘-UTR）區(qū)第+642位二核苷酸重復多態(tài)性（AT）n存在明顯的連鎖不平衡。目前已經(jīng)認識到CDS1的A等位基因與（AT）n最短等位基因明顯相關。有研究顯示CTLA-4（AT）n部位為較長等位基因個體的T細胞反應性增強，CTLA-4mRNA的穩(wěn)定性降低，降解快速，CTLA-4蛋白表達水平下降，T細胞功能增強，最終導致T細胞活化閾值降低，使這些個體發(fā)生自身免疫性疾病的易感性增加。而CTLA-4（AT）n為最短等位基因的個體可以表達高水平的CTLA-4，保護機體免于發(fā)生自身免疫性疾病[5]。

2．CTLA-4與風濕病

        由于CTLA-4是T細胞活化的重要下調(diào)分子，因此人們很容易聯(lián)想到其與自身免疫性疾病發(fā)病間的關系。有研究報道，CTLA-4的多態(tài)性與一些主要由T細胞介導的自身免疫性疾病有關，如Grave’s病、I型糖尿病和多發(fā)性硬化[1]。目前已有許多有關CTLA-4與風濕病方面的研究資料，國內(nèi)也有這方面的研究報道。

2．1．CTLA-4與類風濕關節(jié)炎

        越來越多的實驗室研究表明類風濕關節(jié)炎是一種由T細胞異?；罨鸬淖陨砻庖咝约膊。虼藢TLA-4在類風濕關節(jié)炎中的作用也進行了一系列研究。對CTLA-4基因的研究發(fā)現(xiàn)，在CTLA-4第一外顯子上第49位發(fā)生了A-G的基因突變，造成患者對類風濕關節(jié)炎的易感。Cai等[6]證實在中國人中CTLA-4第49位氨基酸基因多態(tài)性是發(fā)生類風濕關節(jié)炎的危險因素，但在對有關CTLA-4基因多態(tài)性的薈萃分析中發(fā)現(xiàn)，CTLA-4第49位基因多態(tài)性僅在亞洲人與類風濕關節(jié)炎易感有關，歐洲人中則沒有這種易感相關性[7]。表明CTLA-4與類風濕關節(jié)炎易感危險間存在種族差異。

2．2．CTLA-4多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)

        從理論上講，CTLA-4表達或功能降低都會導致自身免疫性T細胞增殖，造成SLE發(fā)病。有4項對CTLA-4基因多態(tài)性和SLE發(fā)病的研究[8]，發(fā)現(xiàn)在CTLA-4第一外顯子第49位的A/G多態(tài)性與SLE的發(fā)病易感性有明確相關，另外也有研究發(fā)現(xiàn)該部位的GG多態(tài)性患者T細胞活化的上調(diào)節(jié)降低，也與SLE的發(fā)病有一定的關系?？赡苓@些基因異常造成的該部位多態(tài)性會通過影響CTLA-4的表達參與SLE的發(fā)病。

2．3．CTLA-4與炎性肌病

        雖然B7家族共同活化分子多與CD4+T細胞相關，但Murata等人的研究顯示[9]，在多發(fā)性肌炎患者正常的、表達MHC-I類抗原分子的肌細胞表面表達共同活化分子B7家族的BB-1，但不表達B7-1或B7-2。這些肌細胞可以與自身免疫性CD8+細胞毒T細胞進行直接的細胞-細胞接觸，并與CD8+細胞毒T細胞表面的CD28和CTLA-4結合。由于這種“不依賴輔助細胞的細胞毒T細胞”不需要CD4+T細胞的存在即能被激活，因此可以在與共同活化分子結合后被活化，啟動自身免疫應答反應，造成組織損傷。在PM患者中，這些表達BB-1的肌細胞起到了專職抗原呈遞細胞的作用，并被細胞因子上調(diào)節(jié)，在肌的免疫損傷中起重要作用。同時該研究還發(fā)現(xiàn)，只有在PM、HIV-相關多發(fā)肌炎和包涵體肌炎中存在這種表達CD28和CTLA-4配體的自身免疫性CD8+T細胞。

2．4．CTLA-4與原發(fā)干燥綜合征（1SS）

        原發(fā)干燥綜合征是以累及外分泌腺體為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，發(fā)病機制尚不明確。雖然研究人員對1SS發(fā)病的免疫機制進行了大量的研究，但有關共同活化分子在1SS發(fā)病中的研究資料不多。有研究顯示，在1SS患者的上皮細胞中發(fā)現(xiàn)有與CD28受體結合的共同活化分子B7-2表達，但與CTLA-4的結合有減少[10]。雖然CTLA-4主要表達于單核細胞，但可以在1SS患者唾液腺的某些區(qū)域上皮細胞表達，可能與CTLA-4與唾液腺上皮細胞結合有關。Bolstad等[10]研究發(fā)現(xiàn)1SS患者的唾液腺CTLA-4mRNA表達明顯升高，而健康正常人唾液腺中沒有表達。

2．5．CTLA-4與Wegener’s肉芽腫

        Wegener’s肉芽腫為累及上呼吸道、肺和腎臟的系統(tǒng)性血管炎性疾病，發(fā)病機制仍不明確，但與自身免疫活性細胞異?；罨嘘P。近來Zhou等[5]對Wegener’s肉芽腫患者的CTLA-4（AT）n基因多態(tài)性進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)患者中攜帶較長等位基因者明顯多于正常對照；攜帶具有保護作用的最短等位基因者明顯少于正常對照，提示CTLA-4基因多態(tài)性與Wegener’s肉芽腫發(fā)病相關。但在全身型Wegener’s肉芽腫患者與局限型、男性和女性患者中沒有觀察到CTLA-4基因型和等位基因方面存在差異；此外，CTLA-4（AT）n等位基因多態(tài)性在抗中性粒細胞抗體（ANCA）陽性和陰性患者中沒有差別，說明CTLA-4（AT）n等位基因多態(tài)性可能僅與Wegener’s肉芽腫的發(fā)病有關，而與臨床表現(xiàn)沒有相關性。

3．CTLA-4融合蛋白治療類風濕關節(jié)炎（RA）

        雖然在不同的風濕病中人們對CTLA-4與發(fā)病的作用進行了相關研究，并且發(fā)現(xiàn)CTLA-4與風濕病的發(fā)病有一定的相關性，但將CTLA-4作為靶點用于患者的臨床治療的報道目前還不多。迄今為止的臨床試驗都是關于CTLA-4單克隆抗體治療RA的安全性和療效的。

        雖然在RA的發(fā)病中有多種免疫細胞參與，但活化的T細胞通過影響細胞-細胞間接觸和產(chǎn)生細胞因子在RA的發(fā)病中起重要作用，因此抑制T細胞的功能從理論上講可以抑制炎癥、控制疾病的進展。由于CTLA-4是目前已知的與免疫應答反應起始有關的T細胞活化共同活化分子，因此CTLA-4就很自然地被選擇為治療的靶點。

        CTLA-4Ig,，品名Abatacept，是由人CTLA-4細胞外部分和人IgG1Fc段形成的融合蛋白，具有能競爭性地與APC細胞表面CD80/CD86結合的很高的活性；防止這些分子與T細胞表面的CD28結合，選擇性地調(diào)節(jié)該共同刺激通路，使T細胞不能完全被活化。在多種動物模型中進行的臨床前研究表明，CTLA-4Ig可以有效治療一些自身免疫性疾病和抗排異作用。人體最早的臨床試驗是在活動期RA且用傳統(tǒng)病情改善藥物治療無效的患者中進行的，旨在確定人體的最佳劑量。結果發(fā)現(xiàn)靜脈注射Abatacept0.5mg/kg、2mg/kg和10mg/kg 85d的患者都有臨床改善，且改善程度具有劑量依賴效應。此后進行的一項II期臨床試驗比較了2mg/kg或10mg/kgAbatacept與MTX聯(lián)合應用及單用MTX治療RA的療效；所有患者都是經(jīng)MTX治療后病情仍然處于活動的患者。治療6個月后，10mg/kgAbatacept+MTX組可以很好地控制癥狀和體征，改善患者和醫(yī)生對疾病的整體評價；而2mg/kgAbatacept+MTX組的療效不滿意。最近報道的一項Abatacept治療RA的臨床試驗是在339名雖然經(jīng)MTX治療但病情仍處于活動狀態(tài)的RA患者中進行的，是一項為期12個月的隨機、雙盲、安慰劑對照臨床研究[11]， 其中有119名患者使用安慰劑+MTX，105名患者使用2mg/kgAbatacept+MTX，115名患者使用10mg/kgAbatacept+MTX。在治療1年時，Abatacept10mg/kg組達到ACR20、ACR50和ACR70的患者分別為62.6%、41.7%和20.9%，而安慰劑組分別為36.1%、20.2%和7.6%，二者相比有顯著差異；而2mg/kgAbatacept組在達到ACR20、ACR50和ACR70的患者人數(shù)上與安慰劑沒有差別；Abatacept治療組的不良反應發(fā)生率與安慰劑組沒有差別。此外該研究還發(fā)現(xiàn)10mg/kgAbatacept治療組患者的功能改善要比安慰劑高3倍。該研究結果表明，Abatacept+MTX對單用MTX無效的RA患者具有一定的療效，而且是安全的，同時也提示小劑量Abatacept的療效差，在治療RA中應該使用較大劑量。

        Genovese等進行了另一項臨床試驗[12]，將322名對抗TNF-a單克隆抗體治療3個月無效的患者隨機、雙盲地分為安慰劑和Abatacept10mg/kg治療組，其中223名患者靜脈輸注Abatacept10mg/kg，99名患者使用安慰劑，這些患者還可以同時服用另外一種傳統(tǒng)病情改善藥物。治療6個月后，發(fā)現(xiàn)Abatacept治療組50.4%的患者達到ACR20，分別有20.3%和10.2%的患者分別達到ACR50和ACR70，明顯優(yōu)于安慰劑組，且Abatacept治療組的不良反應發(fā)生率除感染稍增加外與安慰劑組相比沒有明顯差異，說明Abatacept對那些對抗TNF-a單克隆抗體治療無效的患者仍然有效。

        美國FDA已在2005年12月批準Abatacept應用于治療類風濕關節(jié)炎。

4．CTLA—4Ig 在風濕病治療中的應用前景

        風濕病的治療歷來都是風濕病學界最關注的課題之一，目前所采用的治療藥物以非特異的免疫功能抑制為主，由于缺乏選擇性，對免疫系統(tǒng)的影響也沒有針對性。因此，長期使用這些藥物后，患者患感染性疾病和腫瘤的風險顯著增加；此外傳統(tǒng)抗風濕病藥物的另一個重要問題是相當一部份患者會對這些藥物治療無效，不能阻止病情的進展。近年來基礎免疫學研究的進展使得針對風濕病患者異常免疫反應的某個環(huán)節(jié)的抑制成為可能，生物制劑治療風濕病也成為近十年來風濕病治療最重要的進展之一。但免疫反應本身是一個復雜的網(wǎng)絡，應用生物制劑后并非僅有一個環(huán)節(jié)孤立地受到影響，因此使用生物制劑后會出現(xiàn)一些傳統(tǒng)免疫抑制劑沒有的新問題。例如抗TNF-a單克隆抗體應用于臨床的時間最長，人們對這類生物制劑的了解也最多，雖然這些生物制劑確實給一些對傳統(tǒng)抗風濕病藥物治療無效的患者帶來了更多的益處和更多的緩解癥狀、控制病情進展的機會，但就在這類生物制劑在臨床上普遍應用的幾年之內(nèi)，對其帶來的醫(yī)學問題的報道也有越來越多，如感染的增加尤其是結核菌感染的增加、腫瘤尤其是血液系統(tǒng)的腫瘤、誘發(fā)其他自身免疫疾病等也越來越受到重視。CTLA-4作為免疫系統(tǒng)重要的抑制性共同活化分子，可以從免疫反應的最初階段對免疫反應進行調(diào)控，而且基礎免疫學和基因組學研究都證實在風濕病患者中它的基因和蛋白表達都是異常的，因此，使用針對它的生物制劑來治療風濕病不失為一個令人鼓舞的新手段?，F(xiàn)有報道的臨床試驗都表明，CTLA-4Ig是有效和安全的，而且對抗TNF-a單克隆抗體治療無效的患者仍然有效，因此可以預言，它將會在風濕病的治療中占有一席之地。由于對其認識時間較短，目前的臨床研究還僅局限在類風濕關節(jié)炎。此外，由于CTLA-4在疾病的不同階段的表達情況不同，所以，對于CTLA-4Ig治療風濕病的治療時機選擇還需要進一步研究來確定。此外，與其他生物制劑一樣，感染的機會增加和一些患者療效不佳也是CTLA-4Ig面臨的主要問題。

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摘要：CTLA-4是免疫應答反應起始階段T細胞活化的重要共同活化分子，它與T細胞表面的配體結合后可以抑制T細胞功能，使T細胞不能被激活，從而抑制免疫反應的發(fā)生。在多種風濕病中都發(fā)現(xiàn)有CTLA-4等位基因異常和蛋白表達異常。CTLA-4Ig是針對CTLA-4的融合蛋白，能選擇性地抑制免疫反應，改善患者的臨床癥狀，達到控制疾病進展的目地。但目前的臨床研究尚僅限于類風濕關節(jié)炎。初步臨床研究結果表明CTLA-4Ig治療類風濕關節(jié)炎是有效而安全的，但由于其臨床應用時間短，在風濕病治療中的作用還有待進一步的長期臨床觀察來證實。

關鍵詞：CTLA-4  CTLA-4Ig  風濕病

Co-stimulatory molecule CTLA-4 and the potential application in treating rheumatic diseases

Tian，Xinping， ZengXiaofeng.  Department of Rheumatology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, China, 100730

Abstract:  Rheumatic diseases are characterized by immunological dysfunction. T-cell medicated immune response plays an very important role in the development and persistence of rheumatic disease. CTLA-4 is an important co-stimulatory molecules expressed on T cells. It has inhibitory effect on T-cell mediated immune response. Plenty of evidences have demonstrated that there were abnormalities in CTLA-4 alleles and proteins in patients with rheumatic diseases. Therefore, CTLA-4 has become an target in treating rheumatic diseases. CTLA-4Ig has been developed as an fusion protein which is composed the extra-cellular domain of human CTLA-4 and the Fc fragment of human IgG1. So far, only data about CTLA-4Ig in treating rheumatoid arthritis are available. These data showed that CTLA-4Ig could relieve the symptoms of rheumatoid arthritis and retard the development of the disease. It is safe and effective. In addition, it has demonstrated effectiveness even in patients who failed to response to anti-TNFa monoclonal antibodies. Therefore，CTLA-4Ig is an encouraging therapy for rheumatic diseases. However, since it is has a very short history, long-term study is needed to fully understand its role in the treatment of rheumatoid arthritis.

Key words: CTLA-4  CTLA-4Ig  rheumatic disease