酵母培養(yǎng)操作規(guī)程主要介紹了酵母擴培(培養(yǎng)基制備與接種操作)、實驗室 菌種的保藏及活化、 酵母檢測的方法等等，希望對大家有用，不對的地方，望指正。 第一章 酵母 擴培 §1-1 實驗室擴培 1培養(yǎng)基 制備 【試劑】：冷麥汁、蒸餾水、新鮮雞蛋。 【器具】：試管(15×150)及(18×180)、小巴氏瓶(三角瓶)、大巴氏瓶(大三角瓶)、卡氏罐、中速濾紙、電爐、量筒、不銹鋼鍋、糖度計等。 【儀器】：殺菌鍋、天平(精度0.1g)。 【方法】 〖試管、三角瓶及巴氏瓶培養(yǎng)基的制備〗 ① 取樣：取糖化冷卻麥汁，視麥汁濁度情況判定是否進行過濾。 2℃，按每0.5~1L使用一個雞蛋的比例，加入打成泡沫的蛋清，在不斷地攪拌下保溫30min;然后升溫煮沸30min;將煮沸后的麥汁用水浴冷至80~90℃，用雙層中速濾紙過濾?！愧?澄清：將麥汁加熱至45 0.2°P?！愧?調(diào)糖：將過濾后的麥汁用蒸餾水調(diào)整糖度為11 ④ 分裝：試管(15×150)5mL，試管(18×180)10mL，分裝小巴氏瓶(三角瓶)、大巴氏瓶(大三角瓶)。 ⑤ 滅菌：分裝后包扎好，115℃殺菌20min;殺菌后培養(yǎng)基放置2~3天，確定無菌后備用。 〖卡氏罐培養(yǎng)基的制備〗 取糖化冷卻麥汁(有條件的可取薄板前熱麥汁)加入卡氏罐，然后封閉卡氏罐取樣口，各呼吸閥等接口處均應(yīng)以棉塞或呼吸閥進行封閉后包扎結(jié)實，115℃殺菌30~40min，于室溫冷卻至17~18℃;接種前以3L/min的速率充純氧2~3min(卡氏罐有效容積20L)。 2接種操作 【器具】：酒精燈、酒精棉、剪刀、接種針、鑷子、定量移液器或吸管等。 【儀器】：超凈工作臺等。 【方法】 無菌室使用前，使用紫外線燈照射20~30分鐘進行殺菌;進入無菌室換無菌工作服;所有操作采用無菌操作。 〖活化〗 ① 操作前將冷凍管菌種置于室溫下，使之內(nèi)部培養(yǎng)基達到室溫后，振蕩均勻;無菌操作，將冷凍管內(nèi)的培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)入盛有5mL培養(yǎng)基的試管中，于25±1℃培養(yǎng)72±2小時。 ② 將試管中的培養(yǎng)液輕輕振蕩均勻，用接種環(huán)接取三環(huán)加入另一支盛有5mL培養(yǎng)基的試管中，于25±1℃培養(yǎng)24~36小時。 ③ 將培養(yǎng)結(jié)束的試管培養(yǎng)液輕輕振蕩均勻，用無菌吸管接0.1mL加入盛有10mL培養(yǎng)基的試管，振蕩均勻后于25±1℃培養(yǎng)24~36小時。 〖擴大〗 ① 將培養(yǎng)結(jié)束的試管培養(yǎng)液輕輕振蕩均勻后，全部接入小巴氏瓶(三角瓶)，每個小巴氏瓶(三角瓶)接入一支試管的培養(yǎng)液;然后于23±1℃培養(yǎng)24~36小時。 ② 將培養(yǎng)結(jié)束的小巴氏瓶(三角瓶)輕輕振蕩均勻后，全部接入大巴氏瓶(大三角瓶)，每個大巴氏瓶(大三角瓶)接入一只小巴氏瓶(三角瓶)的培養(yǎng)液;然后于21±1℃培養(yǎng)24~36小時。 ③ 將培養(yǎng)結(jié)束的大巴氏瓶(大三角瓶)輕輕振蕩均勻后，全部接入卡氏罐，每個卡氏罐接入兩只大巴氏瓶(大三角瓶)的培養(yǎng)液;然后于18±1℃培養(yǎng)24~36小時。 〖注〗：除卡氏罐外，其它液體培養(yǎng)基在接種后每12小時應(yīng)振搖一次，以去除二氧化碳，保證酵母耗氧需求。 【實驗室擴培工藝】 容 器 擴大倍數(shù) 培養(yǎng)溫度℃ 培養(yǎng)時間hr 冷凍管→液體試管 活化 25±1 72±2 液體試管 活化 25±1 24~36 液體大試管 活化 25±1 24~36 小巴氏瓶(三角瓶) 10 23±1 24~36 大巴氏瓶(大三角瓶) 10 21±1 24~36 卡氏罐 10 18±1 24~36 注：1.試管至三角瓶階段，至少多做1-2個(支)備用，防止出現(xiàn)意外情況，影響擴培。 2.卡氏罐接種前充純氧，充氧速率3L/min， 2-3min。 §1-2 生產(chǎn)現(xiàn)場擴培 1準(zhǔn)備工作 【設(shè)備準(zhǔn)備】：每次擴培前應(yīng)將待使用的自糖化至漢生罐、擴大罐的管路及漢生罐、擴大罐、連接管路、空氣濾器進行刷洗和滅菌。 【培養(yǎng)基滅菌】：取糖化冷卻麥汁(有條件的可取薄板前熱麥汁)加入漢生罐或擴大罐，進行升溫殺菌。通常在常壓下保持沸騰30~40min即可。殺菌后用無菌空氣備壓0.05MPa后降溫至14±0.5℃?zhèn)溆谩?/p> 2漢生罐接種操作 【接種】：將殺菌麥汁接入漢生罐后，再將已擴培好的卡氏罐菌種接種至漢生罐，擴培比例為1:10~15。 【通風(fēng)】：保證酵母生長對氧的需求，具體通風(fēng)量根據(jù)酵母生長情況調(diào)整，若酵母細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡較多或細胞拉長現(xiàn)象，應(yīng)適當(dāng)增減通風(fēng)量。 【溫度】：接種前控溫在14±0.5℃，接種后培養(yǎng)液自然升溫至16℃，并保持16±0.5℃進行培養(yǎng)。 【備壓】：接種前備壓0.05MPa，接種后保持罐內(nèi)正壓。 【培養(yǎng)時間】：接種后培養(yǎng)36~48hr，待細胞濃度達到35~40×106個/mL方可轉(zhuǎn)罐。 【檢測】接種前的無菌麥汁及接種后的培養(yǎng)液，應(yīng)作微生物檢測。 3擴大罐擴培 【接種】：擴大罐內(nèi)接入冷麥汁(殺菌或不殺菌，保證麥汁無菌)，將漢生罐內(nèi)的培養(yǎng)液充分?jǐn)嚢韬?，全部壓入擴大罐(擴大比例1:5~6)。 【通風(fēng)】：具體通風(fēng)量根據(jù)酵母生長情況調(diào)整，若酵母細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡較多或細胞拉長現(xiàn)象，應(yīng)適當(dāng)增減通風(fēng)量。酵母起發(fā)后，應(yīng)將流量和通風(fēng)時間適當(dāng)減少。 【溫度】：麥汁溫度為12±0.5℃，自然升溫至14℃，并于14±0.5℃控溫培養(yǎng)。 【備壓】：接種前備壓0.05MPa，接種后保持罐內(nèi)正壓。 【培養(yǎng)時間】：培養(yǎng)24~36hr，待酵母數(shù)達到35~40×106個/mL以上時，即可進行下一步擴培。 4二次(車間)擴大罐擴培 將擴大罐的培養(yǎng)液充分?jǐn)嚢韬?，全部壓入二?車間)擴大罐(擴大比例1:3~4)。再向二次(車間)擴大罐進充氧冷麥汁或?qū)ε囵B(yǎng)液進行適度通風(fēng)(麥汁含氧量8mg/L以上)，料溫控制11±0.5℃，接種后自然升溫至12℃，并于11~12℃保溫培養(yǎng);壓力維持罐內(nèi)正壓;培養(yǎng)24±2hr，待酵母數(shù)達到35~40×106個/mL以上時，即可進行追加麥汁或移入發(fā)酵罐進行繁殖。 【車間擴大培養(yǎng)工藝】 容 器 擴大倍數(shù) 培養(yǎng)溫度℃ 培養(yǎng)時間hr 充氧狀況 卡氏罐→漢生罐 10~15 16±1 36~48 根據(jù)情況進行調(diào)節(jié) 擴大罐 5~6 14±1 24~36 根據(jù)情況進行調(diào)節(jié) 二級擴大罐 3~4 12±1 24±2 充氧麥汁 浮選罐或發(fā)酵罐 1~2 10±1 24±2 充氧麥汁 發(fā)酵罐追加滿罐 約1 工藝控溫 24±2 充氧麥汁 第二章 菌種保藏 1實驗室菌種保藏與活化 【形式】：保種形式分為冷凍保種管和固體斜面保藏兩種。 〖冷凍保種管〗：青啤酵母以冷凍保種管的形式提供，-20~-25℃保藏，一次擴培使用一支。 〖固體斜面〗 ① 保藏：其它酵母菌種以固體斜面形式0~4℃冷藏保藏，定期活化; ② 活化：每三個月活化一次。接一環(huán)斜面菌種于5mL麥汁液體培養(yǎng)基中，于25±1℃培養(yǎng)24~36小時;待酵母起發(fā)后，將培養(yǎng)液振蕩均勻，用接種環(huán)涂劃固體斜面，于25±1℃培養(yǎng)60~72小時;然后于0~4℃冷藏保藏。 ③固體斜面菌種每年更換一次。 2漢生罐菌種保藏與活化 【保種操作】 ① 可將正在擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)液由擴培罐壓回至漢生罐，或直接將漢生罐的菌種留約1/5擴培液追加殺菌麥汁進行保種。 ② 培養(yǎng)48~72小時后，至糖度降至7~8°P時，迅速將溫度降至2~4℃進行保種，壓力為0.05MPa。每月更換一次麥汁進行活化，漢生罐菌種使用及活化次數(shù)總共不超過8次。 【活化操作】 ① 將擴培罐麥汁殺菌降溫至12~13℃?zhèn)溆谩?/p> ② 將漢生罐內(nèi)培養(yǎng)液通風(fēng)攪拌后，全部轉(zhuǎn)移至擴大罐中(擴大比1:5~6)，于14±0.5℃進行培養(yǎng)，保持罐內(nèi)正壓，通風(fēng)同擴培。 ③ 待酵母數(shù)達到30×106個/mL以上時，將待留種的培養(yǎng)液打回漢生罐，按【保種操作】②條操作。剩余擴培液可打入發(fā)酵罐。 第三章 酵母檢測 §3-1 取 樣 1擴培液、發(fā)酵液及待濾酒等的取樣 【器具】取樣瓶、便攜式噴燈、酒精噴霧器或酒精棉、打火機; 【方法】 ① 將取樣閥用75%的酒精棉擦拭或酒精噴霧器噴灑酒精，用便攜式噴燈或點燃酒精棉灼燒取樣口(灼燒適度，避免損傷內(nèi)部膠墊)，進行清潔和滅菌; ② 然后打開取樣閥，放出約1000mL液體，關(guān)閉取樣閥; ③ 再次用酒精棉擦拭后，先打開取樣閥，調(diào)整合適的流速，防止液體在取樣時迸濺，用取樣瓶接取樣品約300mL，封閉取樣瓶口; ④ 關(guān)閉取樣閥，用酒精噴霧器噴灑酒精或用酒精棉擦拭，對其進行清潔和滅菌。 2酵母泥的取樣 【器具】取樣瓶、便攜式噴燈、酒精噴霧器或酒精棉、打火機; 【方法】 A回收罐的取樣 ① 將取樣閥用75%的酒精棉擦拭或酒精噴霧器噴灑酒精，進行清潔和滅菌; ② 然后打開取樣閥，放出約1000mL酵母泥，關(guān)閉取樣閥; ③ 先打開取樣閥，調(diào)整合適的流速，防止酵母泥在取樣時迸濺，用取樣瓶接取樣品約200mL后，封閉取樣瓶口; ④ 關(guān)閉取樣閥，用酒精噴霧器噴灑酒精或用酒精棉擦拭，對其進行清潔和滅菌。 B錐形罐的取樣 ① 將錐底閥用75%的酒精棉擦拭或酒精噴霧器噴灑酒精，進行清潔和滅菌; ② 然后打開錐底閥，放出底部摻有凝固物的酵母泥，至流出潔白的酵母泥時關(guān)閉錐底閥; ③ 再次用酒精棉擦拭后，先打開錐底閥，調(diào)整合適的流速，防止酵母泥在取樣時迸濺，用取樣瓶接取樣品約200mL后，封閉取樣瓶口; ④ 關(guān)閉錐底閥，用清水將閥內(nèi)沖洗干凈。 §3-2 檢 測 1酵母細胞形態(tài)檢測 【適用】擴培液、發(fā)酵液、待濾酒、酵母泥等 【原理】在酵母菌的各個生長時期，利用顯微鏡對酵母細胞的外形及內(nèi)容物等進行觀察。 【器具】顯微鏡、載玻片、蓋玻片等。 【方法】 ① 樣品取回后，應(yīng)立即進行檢測;若不能立即檢測，應(yīng)置于冰箱保存，保存時間為0~6℃不超過2小時; ② 取一滴樣品或少量菌體于載玻片上，加數(shù)滴蒸餾水，用拇指和食指夾住蓋玻片兩側(cè)，將其輕輕的蓋于樣品上面，注意不要產(chǎn)生氣泡，用顯微鏡進行檢查; ③ 先使用顯微鏡低倍物鏡(×10)，調(diào)整載玻片位置，對準(zhǔn)樣品視野后換用高倍物鏡(×40)觀察; ④ 優(yōu)良的酵母菌種呈圓形或卵圓形，細胞較飽滿，細胞膜較薄，胞內(nèi)液泡較小，形態(tài)整齊一致;無異狀(拉長)細胞。若觀察擴培液，則出芽率較高，酵母大小的一致性稍差。 2酵母細胞大小測定 【適用】擴培液、發(fā)酵液、待濾酒、酵母泥等 【原理】采用已用鏡臺測微尺校正過的目鏡測微尺和顯微鏡測定單細胞的大小。 【器具】顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、載玻片、蓋玻片等。 【方法】 ① 將目鏡測微尺裝入目鏡內(nèi)，刻度朝下，并將鏡臺測微尺置于載物臺上; ② 用低倍鏡觀察到鏡臺測微尺刻度; ③ 換用高倍鏡測量，先用鏡臺測微尺標(biāo)定，計算出目鏡測微尺每格的長度。移動鏡臺測微尺和轉(zhuǎn)動目鏡測微尺，使二者的刻度平行，并使兩尺的第一條線重合，向右尋找另外相重合的直線，記錄兩重合刻度間目鏡測微尺和鏡臺測微尺的格數(shù)，由下列公式計算目鏡測微尺每格的長度;由于鏡臺測微尺每格長度為10μm，從鏡臺測微尺格數(shù)，求目鏡測微尺每格長度(μm)。 兩重合刻度間鏡臺測微尺格數(shù)×10 目鏡測微尺每格長度(μm) = 兩重合刻度間目鏡測微尺格數(shù) ④ 取下鏡臺測微尺，換上酵母制片，在高倍鏡下測量10~20個酵母細胞的直徑。 3酵母泥外觀檢測 【適用】酵母泥 【原理】應(yīng)用目測方法對酵母泥的外觀進行判斷。 【器具】取樣瓶、燈光。 【方法】 ① 樣品取回后，應(yīng)立即進行檢測;若不能立即檢測，應(yīng)置于冰箱保存，保存時間為0~6℃不超過2小時。 ② 將樣品置于光線充足處，用肉眼觀察?，F(xiàn)場使用的酵母泥應(yīng)有新鮮的光澤，呈乳白色;用手捻開時松散且不粘連。若色澤灰暗、發(fā)粘、有臭酵母味，則說明酵母泥的質(zhì)量較差。 4酵母細胞數(shù)和出芽率的測定(血球計數(shù)板法) A A A A A 【適用】擴培液、發(fā)酵液、待濾酒等 【原理】如圖所示，血球計數(shù)板的計數(shù)室分25個中格，每個中格又分16個小格，所以計數(shù)室內(nèi)共有25×16 = 400個小格;計數(shù)室的容積為1mm(長)×1mm(寬)×0.1mm(高)= 0.1 mm3 = 1×10-4mL;通常計數(shù)5個“A” 區(qū)的酵母細胞總數(shù)。 【器具】顯微鏡、血球計數(shù)板、蓋玻片等; 【試劑】1M H2SO4固定液 【方法】 ① 樣品取回后，應(yīng)立即進行檢測;若不能立即檢測，應(yīng)用1MH2SO4固定液對樣品進行固定;樣品稀釋前應(yīng)充分振蕩均勻，以保證測定結(jié)果反映樣品本質(zhì)。 ② 取50mL容量瓶加入蒸餾水約30mL和1M的H2SO4固定液約2mL，再加入樣品進行適當(dāng)稀釋定容，使計數(shù)時計數(shù)板內(nèi)中格內(nèi)細胞數(shù)在30個左右。 ③ 用拇指和食指夾住蓋玻片兩側(cè)，將其輕輕的蓋于清潔的計數(shù)板上面;將稀釋好的酵母懸液充分振蕩均勻，用清潔的加樣器吸取少許，從蓋玻片的邊緣滴一小滴(不宜過多)，使菌液自行滲入，計數(shù)室內(nèi)不得有氣泡。 ④ 靜置1~2min，置于顯微鏡下計數(shù)。 ⑤ 計數(shù)5個中格“A”中的細胞總數(shù)(包括出芽的細胞)和出芽細胞數(shù)。 【計算】 酵母細胞數(shù)(個/mL)= 5AB×104 其中 A——5個中格的酵母細胞總數(shù); B——稀釋倍數(shù)。 出芽率(%)= 5個中格的出芽細胞數(shù)/5個中格的細胞總數(shù)×100 【注意】*計酵母數(shù)時，位于格線上的酵母菌，一般只計此格的上方及右方線上的菌體; *測定酵母菌出芽率時，當(dāng)芽細胞大于或等于母細胞的1/2時計為兩個細胞，不作出芽計;當(dāng)芽細胞小于母細胞的1/2時，該細胞計為一個出芽細胞。 5酵母死亡率的測定(血球計數(shù)板法) 【適用】擴培液、發(fā)酵液、待濾酒、酵母泥等 【原理】酵母細胞具有還原次甲基紫的一種還原酶。當(dāng)酵母細胞浸于次甲基紫溶液時，色素滲入細胞內(nèi)，活細胞內(nèi)的還原酶將其還原脫色;死細胞的還原酶失活，不能將其脫色，細胞被染成紅色。 【器具】顯微鏡、血球計數(shù)板、蓋玻片等 【試劑】次甲基紫染色液[C =0.01%(W/V)]：將0.01g次甲基紫溶于2%(W/V)二水檸檬酸鈉溶液，定容至100mL。 【方法】 ① 樣品取回后，應(yīng)立即進行檢測;若不能立即檢測，應(yīng)置于冰箱保存，保存時間為0~6℃不超過2小時;樣品稀釋前應(yīng)充分振蕩均勻，以保證測定結(jié)果反映樣品本質(zhì); ② 先把待測的酵母菌(液)用蒸餾水稀釋至每中格中含有大約40~70個左右酵母菌; ③ 取1mL預(yù)先稀釋好的酵母菌懸液加入試管，再加入1mL次甲基紫染色液，搖勻后染色4~5min; ④ 用拇指和食指夾住蓋玻片兩側(cè)，將其輕輕的蓋于清潔的計數(shù)板上面;將染色的酵母懸液充分振蕩均勻，用清潔的加樣器吸取少許，從蓋玻片的邊緣滴一小滴(不宜過多)，使菌液自行滲入，計數(shù)室內(nèi)不得有氣泡; ⑤ 將血球計數(shù)板置于顯微鏡下觀察，死細胞被染成紅色; ⑥ 計數(shù)5個中格“A”中(見4之圖示)的細胞總數(shù)和死細胞數(shù)。 【計算】 酵母死亡率(%)= (染色酵母數(shù)/酵母總數(shù))×100% 6酵母肝糖染色法 【樣本】擴培液、發(fā)酵液、待濾酒、酵母泥等 【原理】肝糖是酵母細胞內(nèi)的貯藏物質(zhì)，通過肝糖檢測可判別酵母的營養(yǎng)狀況;碘化鉀可將肝糖染成紅褐色，從而使含有肝糖的酵母細胞內(nèi)部顆粒呈現(xiàn)紅褐色。 【器具】顯微鏡、血球計數(shù)板、蓋玻片等; 【試劑】碘液：稱取1g碘和3g碘化鉀于研缽中充分研磨均勻，然后在不斷攪拌下加入50mL水進行溶解，稀釋至60mL，于棕色瓶中保存使用，有效期一個月。 【方法】 ① 樣品取回后，應(yīng)立即進行檢測;若不能立即檢測，應(yīng)置于冰箱保存，保存時間為0~6℃不超過2小時;樣品稀釋前應(yīng)充分振蕩均勻，以保證測定結(jié)果反映樣品本質(zhì); ② 先把待測的酵母菌(液)用蒸餾水稀釋至每中格中含有大約40~70個左右酵母菌; ③ 取1mL預(yù)先稀釋好的酵母菌懸液加入試管，再加入1mL碘液，搖勻后染色4~5min; ④ 用拇指和食指夾住蓋玻片兩側(cè)，將其輕輕的蓋于清潔的計數(shù)板上面;將染色的酵母懸液充分振蕩均勻，用清潔的加樣器吸取少許，從蓋玻片的邊緣滴一小滴(不宜過多)，使菌液自行滲入，計數(shù)室內(nèi)不得有氣泡。 ⑤ 將血球計數(shù)板置于顯微鏡下觀察，細胞菌體呈黃色，肝糖顆粒被染成紅褐色; ⑥ 計數(shù)5個中格“A”中(見4之圖示)的細胞總數(shù)和含有染色顆粒的細胞數(shù)。 【計算】 酵母肝糖染色率(%)= (含有染色顆粒的酵母數(shù)/酵母總數(shù))×100% 7酵母凝聚性的測定 【適用】酵母泥等 【原理】應(yīng)用硫酸鈣促凝作用，在酵母沉降一定時間時，利用光密度的方法對其沉降程度進行評估。 【器具】離心機(配50mL塑料離心管)、電子臺秤(0.01g)、分光光度計、比色管(25mL和50mL)、定量吸管(3mL); 【試劑】 ① 醋酸緩沖液：將0.51g硫酸鈣、6.80g醋酸鈉和4.05g冰醋酸溶于水中，定容至1000mL; ② EDTA溶液[C(EDTA)=0.01M]：將3.73g EDTA溶于水中，定容至1000mL; 【方法】 ① 樣品取回后，應(yīng)立即進行檢測;若不能立即檢測，應(yīng)置于冰箱保存，保存時間為0~6℃不超過2小時; ② 離心：將酵母泥樣品振蕩均勻，加入50mL離心管內(nèi)約40mL，于4000rpm轉(zhuǎn)速離心10min，棄上清液; ③ 洗滌：稱取離心酵母泥1.00g于離心管中，加入0.01M的EDTA溶液20mL充分振勻后，于4000rpm離心10min，棄上清液;再次加入相同數(shù)量的EDTA溶液充分振勻，進行洗滌后離心，棄上清液，備用; ④ 轉(zhuǎn)移：在上述酵母泥沉淀中加入醋酸鈉緩沖溶液，并將酵母泥洗滌至50mL比色管中，用醋酸鈉緩沖溶液定容至50mL;轉(zhuǎn)移應(yīng)盡快完成。 ⑤ 靜置：將移入酵母泥懸液的50mL比色管迅速放入20℃恒溫水浴中保溫30min; ⑥ 比色：用定量吸管迅速吸取保溫后的50mL比色管的最上端的3mL液體，并于比色杯內(nèi)混勻后，于670nm以醋酸鈉緩沖液為空白測得吸光度B; ⑦ 原始濁度：稱取離心酵母泥0.50g于離心管中，加入0.01M的EDTA溶液10mL充分振勻后，于4000rpm離心10min，棄上清液;再次加入相同數(shù)量的EDTA溶液充分振勻，進行洗滌后離心，棄上清液;用蒸餾水洗滌至25mL比色管中并定容，充分振蕩均勻后于670nm以蒸餾水為空白測得吸光度A; 【計算】 酵母凝聚性(%)= [(A - B)/A]×100% 8酵母死滅溫度的測定 【適用】回收酵母、實驗室菌種等 【原理】培養(yǎng)基中一定量的菌體在不同的溫度下保溫一定的時間，其保溫后不能生長的溫度即為其死滅溫度。 【器具】恒溫水浴 【試劑】11°P麥汁液體培養(yǎng)基 【方法】 ① 分離：酵母泥取回后應(yīng)立即進行劃線分離，選取所需試驗的菌落進行試驗。 ② 活化：將需要試驗的純酵母菌種(分離后或原始菌種)接一接種環(huán)于5mL麥汁液體培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)36±2小時活化; ③ 富集：將活化后培養(yǎng)液振蕩均勻后，將其接種三環(huán)于5mL麥汁培養(yǎng)基;每一試驗菌種共接8支試管培養(yǎng)基。然后于25℃培養(yǎng)4±0.5小時進行富集; ④ 保溫：將恒溫水浴調(diào)節(jié)溫度至48±0.5℃，將培養(yǎng)后的待測菌培養(yǎng)液振蕩均勻，每只待測菌取兩支試管，與一插有溫度計的的麥汁培養(yǎng)基試管一起放入水浴;待麥汁試管的溫度計的溫度達到48℃時，開始計時保溫10min;保溫終止立即將試驗試管移入冰水降溫至室溫。同樣步驟進行50℃、52℃、54℃的保溫試驗; ⑤ 培養(yǎng)：將保溫后的培養(yǎng)液置于25℃培養(yǎng)5~7天，每天觀察試管中有無菌體生長并記錄; ⑥ 結(jié)論：酵母不能生長的最低溫度即為其死滅溫度。 9酵母發(fā)酵失重實驗 【適用】回收酵母等 【原理】在實驗室內(nèi)使用低接種量，模擬生產(chǎn)現(xiàn)場發(fā)酵，通過稱重方法推算其起發(fā)速度，從而評判酵母的性能。 【器具】離心機(配50mL塑料離心管)、電子臺秤(0.01g) 【試劑】11°P麥汁液體培養(yǎng)基 【方法】 ① 樣品取回后，應(yīng)立即進行檢測;若不能立即檢測，應(yīng)置于冰箱保存，保存時間為0~6℃不超過2小時。 ② 離心：將待試酵母泥樣品充分振蕩均勻，取約40mL加入離心管，于4000rpm離心10min，棄上清液; ③ 接種：將盛有200mL麥汁培養(yǎng)基的三角瓶置于電子臺秤上調(diào)零，用無菌玻璃棒粘取離心后的酵母泥，接種于三角瓶0.4g(相當(dāng)于接種比例2‰); ④ 稱重：然后取下三角瓶，將電子臺秤調(diào)零;對接種后的三角瓶(含塞子)進行全部稱重，并記錄數(shù)據(jù)作為原重;將稱重后的三角瓶置于12℃環(huán)境培養(yǎng)，每隔24小時對其進行稱重并記錄;共稱重10天; ⑤ 發(fā)酵度：發(fā)酵10天后的發(fā)酵液過濾，測定其發(fā)酵度; ⑥ 分析：根據(jù)每天的減重情況及最后的發(fā)酵度測定可分析酵母的起發(fā)、高泡期的糖酵解速度和程度。 10酵母的呼吸缺陷型檢測 【適用】擴培液、發(fā)酵液、酵母泥等 【原理】酵母的呼吸缺陷型突變菌體，主要是由于細胞的線粒體中缺少細胞色素a、a1、a3和b，因而喪失了呼吸能力。當(dāng)2,3,5—三苯基四氮唑鹽酸鹽(TTC)染料和酵母菌落在一起時，呼吸完全型酵母會將無色的TTC還原成紅色，而呼吸缺陷型則無此能力，菌落仍保持原來的白色。 【器具】殺菌鍋、天平、無菌室、接種針、涂布棒等 【試劑】 ① TTC培養(yǎng)基：將TTC(2,3,5-triphenyl tetrazolium chlorde)0.5g、葡萄糖5g和瓊脂20g，加熱溶解后稀釋至1000mL， 于115℃滅菌20min，冷卻備用; ② YEPD培養(yǎng)基：將酵母粉10g、蛋白胨10g、葡萄糖20g和瓊脂20g加熱溶解后稀釋至1000mL，于115℃滅菌20min，冷卻備用;使用前加熱溶解，傾倒平板;該培養(yǎng)基可用麥汁瓊脂培養(yǎng)基替代。 【方法】 ① 樣品處理：樣品取回后，應(yīng)立即進行檢測;若不能立即檢測，應(yīng)置于冰箱保存，保存時間為0~6℃不超過2小時。 ② 菌落的形成 a.將待檢測酵母用接種環(huán)挑取一小環(huán)，接入10mL無菌水，混勻，然后稀釋成不同濃度梯度的稀釋液，稀釋比例為10-4~10-6; b.取稀釋液0.2mL接入YEPD培養(yǎng)基或麥汁固體培養(yǎng)基平板，用無菌涂布棒均勻涂布，每個稀釋度涂布平板2個，取2個平板的菌落數(shù)在50~150個為計數(shù)平板; c.將平板倒置于25℃好氧培養(yǎng)2~3天。 ③TTC培養(yǎng)基覆蓋 a.將TTC培養(yǎng)基溶解后冷卻至45℃左右，立即倒入已形成菌落的平板，覆蓋住所有菌落; b.待培養(yǎng)基凝固后置于25℃培養(yǎng)1~3小時。 ④呼吸缺陷型判定 觀察平板上菌落的顏色。正常菌落為粉紅或紅色;呼吸缺陷型菌落的顏色為白色。 【計算】 呼吸缺陷型百分率(%)=2個平板白色菌落數(shù)/2個平板的總菌落數(shù)×100% 酵母菌主要的代表屬有啤酒酵母屬、裂殖酵母屬、假絲酵母屬等酵母菌培養(yǎng)主要是食品領(lǐng)域等。 |
|
|
