埃博拉病毒出血熱在撒哈拉以南非洲爆發(fā)，此病死亡率可達(dá) 90%。目前，尚未有用于人體的疫苗或有效抗病毒治療藥物。本文，作者評估了吡嗪羰酰胺類 T-705 制劑在體內(nèi)和體外對抗扎伊爾埃博拉病毒（EBOV）的效果。110μM 的 IC90 合成后，T-705 能以 4 個對數(shù)單位的強(qiáng)度抑制扎伊爾埃博拉病毒在細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)制。

在體內(nèi)感應(yīng)試驗(yàn)中，作者使用了缺乏 I 型干擾素受體（IFNAR-/-）的小鼠。小鼠感染后第六天，將 T-705 輸入體內(nèi)，病毒數(shù)量明顯減少，疾病嚴(yán)重程度的生化參數(shù)也有所降低，同時(shí)也防止了受感染動物 100% 的死亡率。研究結(jié)果表明 T-705 是治療埃博拉出血熱的方法之一。

線狀病毒科埃博拉病毒由 4 種病毒類型組成，能導(dǎo)致人類出血熱死亡率高達(dá) 90%。據(jù)記載，扎伊爾埃博拉病毒于 1976 年在剛果民主共和國爆發(fā)（前扎伊爾），扎伊爾埃博拉疫情已在數(shù)個撒哈拉以南非洲國家爆發(fā)。

而埃博拉出血熱的主要特點(diǎn)為：免疫抑制、高病毒血癥和感染性休克類的多器官衰竭。在靈長類動物身上的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)某些疫苗的療效，如：核酸疫苗、病毒載體疫苗和病毒樣顆粒為基礎(chǔ)的疫苗。但是，目前還沒有疫苗獲準(zhǔn)用于人體。

另外，一些藥物可用于感染初期的治療，如：重組線蟲抗凝蛋白 -2（rNAPc2）、雌激素受體調(diào)節(jié)劑、siRNA、干擾素或單克隆抗體中和活性。但這些藥物都對窗口期在兩日以上的感染無療效。針對扎伊爾埃博拉病毒糖蛋白的水泡性口炎病毒為載體的疫苗也顯示其在感染后期的相似作用。

最近研究發(fā)現(xiàn)，如果病毒血癥和癥狀在早期就被發(fā)現(xiàn)，那么把單克隆抗體與胰腺病毒載體上的α干擾素相結(jié)合，便能將療效延長至窗口期 3 日后病毒感染。雖然醫(yī)學(xué)上已有重要發(fā)現(xiàn)，然而就目前對有癥狀的流行性出血熱疾病的臨床管理的迫切需求而言，扎伊爾埃博拉病毒的治療窗仍然太窄。

2002 年，日本的富山化學(xué)工業(yè)公司發(fā)明了吡嗪羰酰胺類 T-705 制劑，該制劑用于抑制流感病毒的復(fù)制；目前，正處于研究其用于流感治療的臨床后期。吡嗪羰酰胺類 T-705 制劑由宿主酶轉(zhuǎn)換為三磷酸鹽，作為核苷類藥物有選擇性地抑制病毒性核糖核酸聚合酶。但是，吡嗪羰酰胺類 T-705 制劑與病毒核酸結(jié)合后，可導(dǎo)致致命的突發(fā)誘變。

除了流感病毒，T-705 對其他體內(nèi)和體外片段負(fù)鏈 RNA 病毒都有有效的抗病毒活性，如沙粒病毒、布亞病毒。

我們參照以上這些報(bào)告，研究中主要針對 T-705 對屬于單鏈負(fù)鏈 RNA 病毒的埃博拉病毒的效果。T-705 化合物（藥物名稱法匹拉韋，CAS 號 259793-96-9；有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù) CID 值 492405）是委托美國創(chuàng)意動力公司 BOC 科技合成。它可溶解于濃度為 10mg/ml 的二甲亞砜（DMSO），存儲溫度為 20℃。

所有試驗(yàn)所用的病毒類型為野生型扎伊爾埃博拉病毒 Mayinga1976 株，并在位于德國漢堡的 BernhardNocht 熱帶醫(yī)學(xué)研究所的 P4 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。大約 1980 年，佐治亞州亞特蘭大市疾控中心提供了該病毒。

自 1976 年起，代次無記載，所以為了精確定義我們的菌株，菌株均全部編排序列號。菌株序列與扎伊爾埃博拉病毒 Mayinga1976 株完全一致（基因庫序號 NC_002549），C1751T 將核蛋白密碼子由 CCC(Pro) 轉(zhuǎn)變?yōu)?TCC(Ser)，G6175A 將糖蛋白密碼子由 AGT(Ser) 變?yōu)?AAT(Asn)。

病毒是在 VeroE6 細(xì)胞（ATCC 序號，CRL-1586）中進(jìn)行培養(yǎng)，由免疫聚集法定量（見下文），在 -70℃下貯存，直到被用來進(jìn)行體外及體內(nèi)試驗(yàn)。

首先，我們對 T-705 在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的抗病毒活性進(jìn)行評估。該化合物 1 小時(shí)前，加入感染倍數(shù)為 0.01 的埃博拉病毒的 VeroE6 細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的二甲亞砜最終濃度為 0.1%。感染五日后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中傳染性埃博拉粒子的濃度由猴抗埃博拉病毒多克?。ㄓ善ぐ? 羅林友情提供）免疫實(shí)驗(yàn)法確定。

細(xì)胞活性是由如上所述的溴化噻唑藍(lán)四氮唑法決定的。T-705 能夠抑制 4㏒單位埃博拉病毒的復(fù)制，其抑菌濃度將病毒滴度減少了 50%，它與目前唯一受測試的單股反鏈病毒目 IC50 屬于同一數(shù)量級，該病菌的名稱為呼吸道合胞體病毒（RSV，IC50= 41 lg/ml）。在 MTT 實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，T-705 內(nèi)并不影響細(xì)胞活性（細(xì)胞毒性濃度將細(xì)胞生長減少了 50%1000 μM）。

然后，我們將 T-705 療效應(yīng)用于動物模型。為了達(dá)到這個目的，我們使用缺少 IFN-alpha/β受體 (IFNAR/) 的小鼠，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀资艿揭吧驮翣柊２├《?Mayinga1976 株的影響。為了排除與小鼠基因有關(guān)的影響，同時(shí)使用了 IFNAR-/-C57BL/6 和 IFNAR-/-129/Sv 兩種小鼠。

所有動物試驗(yàn)都是嚴(yán)格遵循德國實(shí)驗(yàn)室動物科學(xué)學(xué)會規(guī)范并在獸醫(yī)的監(jiān)督下，在安全級別為 4 級的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。該協(xié)議經(jīng)漢堡動物試驗(yàn)倫理委員會的同意。

所有參與該項(xiàng)動物試驗(yàn)的人員均通過了歐洲聯(lián)盟實(shí)驗(yàn)室動物科學(xué)協(xié)會 B 或 C 類教育和培訓(xùn)。試驗(yàn)組包括 5 到 10 只年齡相當(dāng)?shù)哪甘蟆Π２├《镜淖匀火つけ┞队上♂屧?50ll 磷酸鹽緩沖鹽水中的 1000 病灶形成單位通過鼻腔接種形成。T-705 通過使用胃探針每天兩次在 0.5% 的甲基纖維素中執(zhí)行。

IFNAR-/-C57BL/6 小鼠接受了以 300mg/(kg×d) 劑量的治療 6 天或更久。正如我們期待的一樣，未接受治療的埃博拉病毒感染小鼠在感染十日后 100% 死亡。

所有小鼠體重均迅速下降，有些達(dá)到了我們的動物協(xié)議中簽署的臨終極限（最高 20% 的下降率）。在未接受治療的小鼠中，血清氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST 和 ALT）的升高水平達(dá)到了流行性出血熱的標(biāo)準(zhǔn)——病毒血癥高達(dá) 6㏒FFU/ml，體溫持續(xù)降到 32℃以下，符合休克的癥狀。

接受治療的第一天，T-705 組小鼠的體重下降程度和對照組相似，發(fā)展成病毒血癥，AST 和 ALT 血清水平升高，出現(xiàn)了埃博拉病毒的感染跡象。開始治療兩天后，接受治療小鼠的 AST 和 ALT 水平和病毒血癥與對照組相比急速下降。接受治療后的四天，受試小鼠的血液中已經(jīng)沒有了病毒的跡象。治療時(shí)間持續(xù)了 13 天，在三周的觀察期末，所有小鼠痊愈（100% 治愈率，對照組死亡率 100%）。

所有通過了免疫熒光試驗(yàn)的治愈的小鼠獲得了埃博拉病毒抗體及病毒核蛋白質(zhì) CD8T 細(xì)胞，這表明 T-705 對病毒的抑制作用使得受體即使在缺乏 IIFN 信令指標(biāo)的情況下也能增加病毒特異性免疫應(yīng)答。

為了確定 T-705 的治療窗，第八天以 300mg/(kg×d) 的用量對一組小白鼠進(jìn)行了給藥。這次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，AST、ALT 和病毒血癥均達(dá)到了峰值，體溫下降。體重的降低就是證據(jù)，與人類的臨終界限接近。T-705 治療延遲了死亡時(shí)間，降低了即使是在臨終狀態(tài)的小鼠中的 1/5 病毒負(fù)荷和生化疾病，但是未能阻止死亡。

因此，在 IFNAR-/-C57BL/6 小鼠模型中，T-705 對扎伊爾埃博拉病毒感染 6 日內(nèi)的高病毒血癥和明顯的疾病跡象是有治療效果的，但對處于發(fā)病晚期的癥狀幾乎沒有療效。

IFNAR-/-129/Sv 小鼠接受的藥物治療方案為：第 2 至第 9 天給藥 30mg/(kg×d)；或第 2 至 9 天、第 4 至 11 天或第 6 至 13 天的時(shí)候給藥 300mg/(kg×d)。

奇怪的是，除了顯而易見的疾病臨床指標(biāo)和生化指標(biāo)之外，接近 80% 未接受治療的小鼠收到了感染但未死亡。這與前面霧化 Zaire1976EBOV 對 IFNAR-/-129/Sv 小鼠致命的結(jié)果恰好相反。這樣截然相反的結(jié)果可能是因?qū)嶒?yàn)所使用的菌株不同而引起的（實(shí)驗(yàn)使用的菌種為 ZaireEBOV E718 1976 和 Mayinga)。

此外，Lever 等的研究使用碰撞噴霧器，產(chǎn)生的顆粒直徑集中在 1-3μm，這樣大小的顆粒易在呼吸道沉積，而不易在鼻腔內(nèi)定植。從圖 3 可以看出，對照組小鼠第 8 天時(shí)的血清 AST 水平為 352-9500U/I，ALT 水平為 210-2400U/I，相反，所有使用 T-705 的小鼠，其血清 AST 和 ALT 水平都顯著降低（p 值分別為 p=0.0016-0.0031 和 p=0.001-0.002；使用 Mann-WhitneyU 檢測）。

另外，8 天后對照組小鼠血清平均病毒生物量為 5.1×105FFU/ml，而經(jīng) T-705 治療的實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中沒有檢測到病毒，而與初始給藥劑量和用藥時(shí)間無關(guān)（p=0.02-0.0055；使用 Mann-WhitneyU 檢測）。八天后，所有實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存率、體重減輕以及體溫都沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與 C57BL/6 小鼠相似，所有存活下來的 129/Sv 小鼠的 EBOV 特異性抗體和 CD8T 細(xì)胞都有所增加（數(shù)據(jù)未列出）。

據(jù)我們所知，T-705 是第一種經(jīng)動物模型證實(shí)，針對扎伊爾埃博拉病毒早期感染有效的治療藥物。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在受感染 6 天內(nèi)使用該藥物可減輕病毒血癥、改善病癥的臨床和生物學(xué)癥狀，避免死亡。

用藥時(shí)間相當(dāng)于對照實(shí)驗(yàn)動物死亡的前 2-4 天。我們的研究與對接受埃博拉病毒噴霧處理后 1 小時(shí)的小鼠使用 T-705 可避免 IFNAR-/-129/Sv 小鼠死亡的新聞報(bào)道相一致且有所延伸。T-705 的另一優(yōu)勢是能夠通過口服途徑減輕 EBOV 病毒血癥。

這與利巴韋林相當(dāng)，其可口服治療其它出血性發(fā)燒如拉沙熱，但對絲狀病毒無效。數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，T-705 是活躍在體內(nèi)對抗組成許多人病原體的具有單股反鏈病毒目順序的病毒。前面的例子證明，T-705 在體外對抗副粘病毒呼吸道合胞病毒比分割負(fù)鏈 RNA 病毒更難，這在一定程度降低了假定使用 T-705 于非節(jié)段負(fù)鏈 RNA 病毒的樂觀性。

對于 EBOV，T-705 的 IC 50 比對流感病毒或沙粒病毒更高。不過，該藥顯示的體內(nèi)效果明顯，T-705 有希望對其他病毒等有抑制作用，在體外只有在相當(dāng)高的藥物濃度才能達(dá)到體內(nèi)的療效。

在 EBOV 感染的情況下，我們推測 T-705 在體內(nèi)抑制病毒復(fù)制，使宿主免疫系統(tǒng)的自適應(yīng)臂有效地對付病毒感染，從而有助于 T-705 的治療效果。這與之前的數(shù)據(jù)所顯示的結(jié)果 EBOV 血癥水平與宿主的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度之間的關(guān)聯(lián)一致。更多可以確定在 T-705 治療中免疫反應(yīng)參與的試驗(yàn)正在進(jìn)行。在各種小動物模型中，T-705 已經(jīng)被證明有效抑制 RNA 病毒復(fù)制。

這些發(fā)現(xiàn)和數(shù)據(jù)使得我們的研究結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)楦F(xiàn)實(shí)的流行性出血熱模型更為謹(jǐn)慎樂觀，如除人類之外的其他靈長類動物，并最終臨床實(shí)踐。