5月16日Science雜志發(fā)表了題為“Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution”的綜述性文章，指出近期的一些生化試驗(yàn)和結(jié)構(gòu)研究有助于解析Cas9這種關(guān)鍵酶，這些研究成果為未來合成生物學(xué)，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究，以及新一代基因組工程中的新應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

CRISPR本身是一種防御系統(tǒng)，用以保護(hù)細(xì)菌和古細(xì)菌細(xì)胞不受病毒的侵害。在這些生物基因組中的CRISPR位點(diǎn)能表達(dá)與入侵病毒基因組序列相匹配的小分子RNA 。當(dāng)微生物感染了這些病毒中的一種，CRISPR RNA就能通過互補(bǔ)序列結(jié)合病毒基因組，并表達(dá)CRISPR相關(guān)酶，也就是Cas，這些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA ，阻止病毒完成其功能。

將CRISPR/ Cas系統(tǒng)用于其它非細(xì)菌細(xì)胞需要滿足兩個(gè)條件：一個(gè)Cas酶，用于切斷靶標(biāo)DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一個(gè)就是稱為導(dǎo)向RNA（gRNA）的RNA分子，這種分子能通過互補(bǔ)結(jié)合靶標(biāo)。

其中Cas酶至關(guān)重要，為了能更好的利用這一技術(shù)工具，不少實(shí)驗(yàn)室解析了這種酶的精確分子機(jī)制，探索其如何靶向和作用于DNA的。近期Sternberg等人就確定了Cas9在病毒感染過程中是如何在RNA序列的引導(dǎo)下識(shí)別和降解外源DNA，以及在動(dòng)物和植物細(xì)胞中誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性遺傳改變的。

研究人員通過結(jié)合單分子成像和大量的生化試驗(yàn)，證實(shí)Cas9的基因組編輯能力是通過稱作為“PAM”（ protospacer adjacent motif）的短DNA序列來實(shí)現(xiàn)的。這一研究揭示了PAM的兩個(gè)主要功能，解釋了它對(duì)于Cas9能夠靶向和切割與導(dǎo)向RNA相匹配的DNA序列如此至關(guān)重要的原因。在外源DNA的靶向位點(diǎn)附近存在PAM，而宿主基因組的這些靶向位點(diǎn)則缺乏PAM，使得Cas9能夠精確區(qū)分必須降解的非自身DNA和幾乎完全相同的自身DNA。此外，存在PAM也是激活Cas9酶的必要條件。

研究人員指出，Cas9只在識(shí)別PAM后才利用RNA–DNA堿基配對(duì)來解讀DNA尋找匹配的序列，這樣避免了意外地靶向細(xì)菌自身基因組中的匹配位點(diǎn)。然而，即使Cas9以某種方式與自身基因組中的一段匹配序列錯(cuò)誤地結(jié)合，沒有PAM也無法觸發(fā)催化核酸酶的活性。利用這種DNA解讀機(jī)制，PAM提供了兩個(gè)冗余的檢查點(diǎn)，確保Cas9不會(huì)錯(cuò)誤地破壞它自身的基因組DNA。

此外，在結(jié)構(gòu)研究方面，瑞士蘇黎世大學(xué)、美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校等處的研究人員今年2月首次解析出酶Cas9的詳細(xì)三維結(jié)構(gòu)圖：研究人員利用X射線晶體分析法獲得兩種主要類型的Cas9酶的2.6埃和2.2埃分辨率的晶體結(jié)構(gòu)圖。然后利用單顆粒電子顯微術(shù)(single-particle electron microscopy)揭示出Cas9與它的導(dǎo)向RNA(guide RNA, gRNA)如何合作從而與靶DNA序列相互作用。

結(jié)構(gòu)分析顯示Cas9具有相同的結(jié)構(gòu)核心，這個(gè)結(jié)構(gòu)核心的特征為一種具有兩個(gè)主葉(major lobe)——一個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域葉和一個(gè)α-螺旋葉---的蛤蜊形狀(clam-shaped)的結(jié)構(gòu)。這兩個(gè)主葉含有保守性的裂縫，而這些裂縫在核酸結(jié)合中發(fā)揮功能。

還有來自麻省理工等處的研究人員首次報(bào)道的Cas9復(fù)合體的高分辨率圖片，從中揭示出這種Cas9復(fù)合體的勞動(dòng)分工。

研究人員發(fā)現(xiàn)Cas9由兩個(gè)裂片(lobe)組成：一個(gè)裂片參與識(shí)別向?qū)NA和靶DNA組分，另一個(gè)裂片負(fù)責(zé)切割靶DNA，導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂從而讓靶基因失去功能。而且他們也發(fā)現(xiàn)Cas9與導(dǎo)向RNA之間的界面上的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)，當(dāng)Cas9準(zhǔn)備切割靶DNA鏈時(shí)，這些結(jié)構(gòu)允許Cas9在導(dǎo)向RNA和靶DNA周圍自我組裝。

這些生化機(jī)理和結(jié)構(gòu)上的重要成果將有助于解決CRISPR系統(tǒng)應(yīng)用中的一些問題，從而更好的改進(jìn)CRISPR技術(shù)，滿足科學(xué)家們的要求。（生物通：張迪）

原文摘要：

Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution

The ability to add, remove, or change DNA sequences is essential to studies that investigate the genetic under-pinning of phenotypic traits. With its unprecedented ef? ciency and stunning ease of use, DNA editing technology based on the prokaryotic CRISPR (clustered regularly interspersed short palindromic repeats)Cas9 system is completely revolutionizing genome engineering. In little more than a year, CRISPR-Cas9 editing has been implemented in a multitude……

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