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作者：花花是個(gè)學(xué)術(shù)張

單位：南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院

解螺旋出品，轉(zhuǎn)載須經(jīng)授權(quán)

　　花花相信大家對(duì)IHC一定不陌生，世界那么大，實(shí)驗(yàn)方法層出不窮，但是免疫組化卻是經(jīng)典中的經(jīng)典，想看看別的高大上的技術(shù)？不急，我們先來(lái)復(fù)習(xí)復(fù)習(xí)免疫組化。

　　免疫組化，免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry），是一項(xiàng)利用抗原抗體反應(yīng)，通過(guò)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對(duì)蛋白定位，定性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

　　免疫組化主要用的是組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，組織標(biāo)本包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。石蠟切片，對(duì)組織形態(tài)保存好，保存時(shí)間也長(zhǎng)，雖然對(duì)組織抗原暴露有影響，但可以抗原修復(fù)，所以石蠟切片仍然是首選的標(biāo)本制作方法。

　　好了，重點(diǎn)來(lái)了，下面是花花多年來(lái)總結(jié)的免疫組化步驟和經(jīng)驗(yàn)，各位看官不要錯(cuò)過(guò)哦！

① 在60°烤箱烤片30~60min，這一步是為了使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化，好讓組織切片牢固貼在玻片上。做切片是免疫組化的前提切片子最好是找專業(yè)培訓(xùn)過(guò)的人員切片，片子的厚薄均勻，切片的完整，無(wú)褶無(wú)刀痕?？佳械豆さ臅r(shí)候。

② 脫蠟水化，依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10min，乙醇梯度（高至低）各2min，水。然后用自來(lái)水洗一下，但不要直接對(duì)著切片沖洗。

③ 抗原修復(fù)，小編用的是高壓熱修復(fù)，ph6.0的檸檬酸鹽緩沖液，一定要全部浸泡切片，等高壓鍋冒氣后5min結(jié)束，自然冷卻，溫度驟降可能引起脫片哦。3%H2O2避光浸泡15min（當(dāng)然有的朋友用EDTA修復(fù)或者說(shuō)使用微波修復(fù)等方法也是可以的，但是每一種抗體對(duì)不同的抗原修復(fù)方法的反應(yīng)是不一樣的，得具體對(duì)待。）

④ 這一步有神器，用“組傳”的免疫組化油筆圍繞組織畫(huà)圈，接下來(lái)就能看見(jiàn)它的功效了。 PBS洗5min x 3次。PBS會(huì)被鎖在畫(huà)的圈中，不會(huì)流干，保證不干片。

⑤ 滴加5%BSA （BSA用PBS溶）稀釋的一抗，每個(gè)組織約20ul，用200ul的槍頭尖端抹平，4°過(guò)夜或者37°1~2h，小編用的是第二種方法。（每種組織大小不一樣，面積大概1乘1的可以20ul就夠了，對(duì)于類似NPC的組織就沒(méi)必要這么大了，關(guān)于一抗的問(wèn)題，個(gè)人建議4°過(guò)夜的方法，當(dāng)然37°1~2hour也是可以的，兩種方法沒(méi)法說(shuō)誰(shuí)好誰(shuí)不好，不同的抗體對(duì)方法的敏感性是不一樣的）再次PBS洗5min x 3次。

⑥ 滴加二抗，一滴每個(gè)，用200ul的槍頭尖端抹平，室溫靜置30min。（本人用的是××公司（此處堅(jiān)決不植入廣告）貨號(hào)GK500705的二抗檢測(cè)試劑盒，很好用，極力推薦。）

⑦ 再次PBS洗5min x 3次

⑧ DAB- H2O2顯色10min。（B：C=1:50，25ul每個(gè)，現(xiàn)配現(xiàn)用），在這時(shí)要觀察，如果染色明顯，不到10分鐘即可蒸餾水洗終止顯色，但是一般超過(guò)20min都不會(huì)有什么好結(jié)果。

⑨ Mayer蘇木素染色30s，水洗，鹽酸酒精分化3s，流水浸15min

⑩ 脫水,乙酸2min，乙醇梯度（低至高）各2min，二甲苯5min

中性樹(shù)膠封片。

結(jié)果分析：

鏡下細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽(yáng)性結(jié)果呈深淺不一的棕色

比如這樣：

　　結(jié)果分析主要有兩種方法，陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法和評(píng)分法。前者是在40*光鏡下，隨機(jī)10個(gè)視野下計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞；后者則是在光學(xué)顯微鏡下按染色程度（0分陰性著色，1分淡黃色，2分淺褐色，3分深褐色）和陽(yáng)性范圍（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）評(píng)分，最終分?jǐn)?shù)相加。

再來(lái)看下反面教材

最常見(jiàn)的非特異性著色：

還有背景過(guò)深的：

要避免成為上述的兩種典型，做出一張可以見(jiàn)老板的結(jié)果，每步都要且做且思考。花花再啰嗦幾句：

1 脫蠟和脫水的步驟呢，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有自己獨(dú)到的方法，用的乙醇的梯度不完全相同，大家按照自己的習(xí)慣那套來(lái)就好。但要注意，脫蠟和水化不全引起局灶性反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致非特異性著色。

2 一定要防止干片！干片也很容易引起非特異性著色。

3 在用槍頭抹平抗體時(shí)，要盡量將槍頭放平，用斜面而不要用尖頭接觸組織，這一步要輕柔小心，可能你只是輕輕刮到幾下，但鏡下組織就變得亂七八糟的了（別問(wèn)我是怎么知道的）

4 PBS在洗的時(shí)候，不要對(duì)著組織沖洗，會(huì)脫片。小編的方法是將沖洗著力點(diǎn)放在玻片的邊緣，讓液體自然流向組織。

5 一抗?jié)舛戎陵P(guān)重要，這直接影響了最終的結(jié)果，摸條件時(shí)設(shè)置一抗?jié)舛忍荻取＝ㄗh同時(shí)設(shè)置一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，可以排除一抗之外的操作問(wèn)題。

6 背景染色過(guò)深的話，就要考慮一抗?jié)舛冗^(guò)高或者一抗時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)這些問(wèn)題了。

7 降低組織非特異性染色，可以縮短一抗，二抗的時(shí)間，稀釋抗體，也可以增加幾次PBS沖洗。或者直接用單抗。

　　免疫組化往往作為檢測(cè)某蛋白在組織的表達(dá)情況出現(xiàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，免疫組化的結(jié)果可能將直接影響課題的后續(xù)設(shè)計(jì)和進(jìn)展。如果說(shuō)我們的科研課題是一個(gè)大世界的話，免疫組化是我們看向這個(gè)世界的敲門(mén)磚。

做好免疫組化

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