分子生物學實驗必背十題

bluewhale 2016-01-04

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1、簡述雙抗體夾心法（ELISA）原理定義、操作過程、注意事項。

（1）原理定義：將可溶性的抗原或抗體吸附到固相載體上，并保持其免疫活性，使之結(jié)合并吸附結(jié)合抗體或抗原，通過洗滌去除未結(jié)合成分，再與酶標記的抗體或抗原結(jié)合，并保留酶的活性，然后加入酶反應(yīng)的底物，后者被催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)反應(yīng)顏色的深淺進行免疫反應(yīng)的定性和定量的方法。

（2）操作過程：

①用一直抗體包被固相載體；

②加入受檢的標本（含待測抗原），使抗原與固相上的抗體結(jié)合；

③加入以辣根過氧化物酶標記的已知抗體，使之與抗原結(jié)合。標記的酶可催化底物（四甲基聯(lián)苯胺）起顯色反應(yīng)，從而指示特異性抗原抗體反應(yīng)的存在。

（3）注意事項：

①對倍稀釋抗原混勻時不要產(chǎn)生太多氣泡；

②酶標板要洗滌干凈不要交叉污染；

③加樣時從最低稀釋度逐一加至最高稀釋度。

2、比較聚丙烯酰胺凝膠電泳與聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳。

（1）相同點：都是電泳方法，可用于物質(zhì)的分離與鑒定。

（2）不同點：前者利用蛋白質(zhì)分子大小形狀的差異進行分離，后者利用的是兩性電解質(zhì)形成的光滑pH使蛋白質(zhì)停留在與其pI相等的位置上進行分離；前者有擴散的作用，后者無擴散作用，因而物質(zhì)更集中，分辨率高；電泳時間加長，前者電泳效果會變差，后者可使同一蛋白區(qū)帶更狹窄，利于分辨。

3、比較向聚丙烯酰胺薄膜層析和凝膠柱層析。

（1）相同點：都是層析方法，可用于分離物質(zhì)；固定相均為固體，流動相均為液體；與分離物質(zhì)不發(fā)生反應(yīng)，分離后可鑒定。

（2）不同點：前者屬于特殊的吸附分配層析，后者屬于分子篩層析；前者通過熒光觀察判斷分離物質(zhì)，后者通過收集液的顯色反應(yīng)；前者原理與分離物質(zhì)與聚丙烯酰胺薄膜形成氫鍵有關(guān)，后者利用分子顆粒大小有關(guān)。

4、使牛蛙紅細胞細胞融合的試劑及其原理；紅細胞計數(shù)。

（1）PEG；PEG具有強烈的吸水和凝聚沉淀蛋白質(zhì)的作用，可改變細胞膜的結(jié)構(gòu)，使兩細胞接觸點處脂類分子發(fā)生分散和重組，引起細胞融合。

（2）計數(shù)：格子數(shù)；稀釋倍數(shù)。

5、兩種核酸提取的基本要求和鑒定方法。

（1）DNA

基本要求：保持DNA大分子的完整性及純度；避免機械張力剪切，操作輕柔；注意對雜質(zhì)蛋白和RNA的去除；防止DNA酶對DNA的降解。

鑒定方法：A260/A280比值在1.8左右；瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠熒光顯色，觀察條帶。

（2）RNA

基本要求：全程要防止RNA酶污染，對實驗器具要預先處理，可加入特異性RNA酶抑制劑，實驗中要佩戴一次性口罩手套。

鑒定方法：A260/A280比值在2.0左右；瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠熒光顯色，觀察28S亮度是否為18S兩倍。

6、PCR的原理以及反應(yīng)體系中各組分的作用。

（1）PCR原理：

該技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的情況下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段DNA片段來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3’-OH末端，并以此為起點，沿模板5’→3’方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。而新合成的鏈又可作為下一輪反應(yīng)的模板，如此循環(huán)往復，每循環(huán)一次，DNA分子數(shù)即按指數(shù)倍增（2n）。

（2）反應(yīng)體系中各物質(zhì)作用：

①模板DNA：DNA復制模板；

②引物：開始階段結(jié)合到DNA模板的一段互補序列部位，啟動DNA雙鏈的合成；

③4種脫氧核苷酸：合成DNA原料；

④耐熱的DNA聚合酶：催化DNA鏈合成；

⑤適宜的緩沖液：維持合適pH，以保持酶的活性并幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。

7、小鼠脾單個核細胞的分離，離心后從上到下都是什么成份；分離的原理；淋巴細胞濃度的計算。

（1）從上到下分別是：稀釋的血漿；單個核細胞；粒細胞；紅細胞。

（2）原理：本次實驗根據(jù)顆粒沉降原理，將不同密度的小鼠脾臟細胞置于淋巴細胞分離液上進行水平式離心，使單個核細胞在其沉降運動中位于分離液潔面上；達到分離小鼠脾單個核細胞的目的。已知小鼠淋巴細胞和單核細胞的密度約為1.088，而紅細胞與粒細胞的密度均大于1.088。因此，用密度為1.088±0.001的淋巴細胞分離液通過密度梯度離心方法，可從小鼠脾臟細胞分離得到單個核細胞。

（3）計數(shù)：格子數(shù)；稀釋倍數(shù)。

8、簡述對流免疫電泳原理。

對流免疫電泳是電泳技術(shù)與雙向瓊脂擴散技術(shù)相融合而形成的一種定向加速的凝膠內(nèi)免疫沉淀反應(yīng)。與雙向瓊脂擴散技術(shù)中抗原與抗體分別向四周自由擴散不同，對流免疫電泳在凝膠中加一直流電場，抗原和抗體受到電泳和電滲兩種力量的綜合作用而向某一方向定向加速移動，因此可以提高靈敏度，明顯縮短反應(yīng)時間。

9、寫出2種蛋白質(zhì)定量方法，并擇一詳述。

（1）標準曲線法；標準管法。

（2）標準曲線法：雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物，在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)生成紫紅色絡(luò)合物，此反應(yīng)即為雙縮脲反應(yīng)。含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都具有雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)含有多個肽鍵，在堿性溶液中能與銅離子絡(luò)合成紫紅色化合物。其顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，可以用比色法進行鑒定。

10、簡述等電聚焦電泳中Ampholine& AP & TEMED、聚酰胺薄膜、秋水仙素、細胞融合中PEG、DNA純化中EDTA & SDS、CDC實驗中石蠟油 & 抗淋巴血清 & 細胞培養(yǎng)液 & 補體 & 錐藍的作用。

（1）Ampholine：在直流電場作用下，能從正極到負極形成一個pH逐漸升高的平滑連續(xù)而且穩(wěn)定的pH梯度，從而在電泳中實現(xiàn)等電點不同的物質(zhì)的分離；

AP：引發(fā)凝膠的聚合；

TEMED：加速凝膠的聚合。

（2）聚酰胺薄膜：由于分離物質(zhì)和展層劑的不同，其與聚酰胺薄膜上的酰胺基團競爭形成氫鍵的能力也不同，從而可以利用其泳動速度差異，實現(xiàn)不同種物質(zhì)的分離。

（3）秋水仙素：抑制紡錘體形成，使細胞周期停留在中期，便于觀察。

KCl低滲溶液：使得細胞膨脹，利于中期染色體的觀察。

（4）PEG：具有強烈的吸水和凝聚沉淀蛋白質(zhì)的作用，可改變細胞膜的結(jié)構(gòu)，使兩細胞接觸點處脂類分子發(fā)生分散和重組，引起細胞融合。

（5）EDTA：絡(luò)合二價金屬離子，當Mg2+被絡(luò)合后，細胞內(nèi)釋放出來的DNA酶被抑制，避免DNA的降解，同時金屬離子絡(luò)合后，細胞膜穩(wěn)定性下降，有利于膜的裂解；

SDS：使蛋白質(zhì)變性，能破壞膜蛋白的構(gòu)象，使膜裂解，又能使核蛋白中的核酸與蛋白質(zhì)解離，并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。

（6）石蠟油：密封細胞反應(yīng)板，防止污染，利于孵育；

抗淋巴血清：作為抗體提供補體結(jié)合位點與補體結(jié)合，使其活化形成MAC；