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專利名稱真菌發(fā)酵生產天然脫落酸的新方法 技術領域本發(fā)明屬于用真菌發(fā)酵法生產天然活性脫落酸的發(fā)酵工程。 脫落酸(Abscisic Acid，簡稱ABA)是目前世界上已發(fā)現的五大植物荷爾蒙之一。天然型的ABA由于對農作物的生長發(fā)育具有很強的調控活性，能促進果實類、谷類、豆類的成熟發(fā)育，能大幅度提高其產量和質量，又能大大增強其耐寒、抗旱和耐鹽能力，因而具有廣闊的應用前景。目前，ABA在基礎領域的研究已深入到植物細胞與基因工程水平。然而，由于存在于植物體內的天然活性ABA光學構型僅為(S)-(+)-ABA，單純的(S)-(+)-ABA的生產成本極高，售價昂貴，而人工合成的ABA，得到的是Racemid型，活性遠小于天然型的ABA，因此，ABA應用于農業(yè)生產幾乎是空談。為了解決和滿足ABA應用于農業(yè)生產的問題，近二十年來，國外開始利用微生物發(fā)酵法來生產天然活性脫落酸。1977年，意大利G.Assante首先采用Cercospora Rosicola發(fā)酵生產天然活性脫落酸，主要為固體發(fā)酵，但由于其產量很低，其商品價格很高(193.4美元/毫克)，1982年，日本的丸茂晉吾發(fā)現利用真菌Botrytis Cinerea可生產天然活性ABA，并申請了專利，其后，于1987，1988，1990年，日本東麗公司和新日本化學工業(yè)公司的松本俊一等、相繼用Botrytis菌株生產天然活性脫落酸，申請了六項專利，生產工藝分別為固體發(fā)酵，也育液體搖瓶發(fā)酵，同時采用了纖維素泡沫作載體的液體發(fā)酵，發(fā)酵產量已由15-20mg/升培養(yǎng)基提高到23.8-85mg/升發(fā)酵液，最高的產量已達300mg/L。但以上的專利還存在①發(fā)酵產量低；②發(fā)酵工藝尚局限于固體發(fā)酵和液體批次發(fā)酵，沒有充分利用菌體連續(xù)產生脫落酸的特性。菌體在一個固定的培養(yǎng)環(huán)境中生長，產酸，當產物(脫落酸)達到一定濃度時，產生抑制作用，菌體不再分泌產物，造成營養(yǎng)物質、菌體和能源的浪費，使產量不能提高，生產效率低，成本高。仍然不能解決應用于農業(yè)生產上的問題。 本發(fā)明的任務是尋找一個能大幅度提高脫落酸產量的新工藝，大幅度降低脫落酸的生產成本，使工業(yè)化規(guī)模生產成為可能。 本發(fā)明的技術解決方案1.改造現有的脫落酸產生菌株為高產菌株，大幅度提高菌種的發(fā)酵活性。 2.改液體批次發(fā)酵工藝為固定化菌體連續(xù)流加補料、出料、PH控制的(起始PH控制、生長期PH控制、生產期PH控制、發(fā)酵終了期PH控制)發(fā)酵工藝。 3.選擇更適合于菌體生長、產酸的培養(yǎng)基配方。 4.通過添加關鍵底物、周控菌體發(fā)酵的代謝途徑，大幅度提高脫落酸產量。 本發(fā)明使用的菌種為Botrytis Cinerea-Cercospoxa RosicolaFD338(簡稱B.C.FD338)。該菌是用葡萄孢霉屬菌株Botrytis CinereaT-1進行原生質體誘變后再同另一脫落酸產生菌Cercospora Rosicola216進行原生質體融合及相關遺傳誘變處理所獲得的高產脫落酸菌株。 本發(fā)明采用三級連續(xù)發(fā)酵，根據三級不同要求，選擇了三種不同的培養(yǎng)基A、B、C。其組成為培養(yǎng)基A葡萄糖0.2-2％ 牛肉膏0.1-1％ 酵母膏0.1-1％甘露糖0.1-0.5％ 麥芽汁5-20％ 玉米漿0.001-0.05％(或蔗糖0.1-0.5％，鼠李糖0.1-0.5％，蛋白胨0.1-1％ 甘油0.1-1％， 生物素0.001-0.05％)NH4NO30.1-0.5％ MgSO40.05-0.3％，KCl 0.1-0.3％K2HPO40.05-0.5％培養(yǎng)基B米糠汁20-70％(或淀粉0.5-5％，糊精0.1-2％)廢糖蜜0.5-7％(或纖維二糖0.5-5％，或乳糖0.5-5％或半乳糖0.5-5％，蔗糖0.1-3％)豆餅粉0.1-2％(或花生餅粉0.1-2％，或棉籽餅粉0.1-3％)谷氨酸0.01-0.5％，(NH4)2SO40.01-0.8％ (或尿素0.1-1％)MgSO40.05-0.3％ KCl 0.1-0.3％ 硫胺素0.0001-0.05％培養(yǎng)基C糊精0.1-3％麥麩汁20-70％(或玉米粉0.1-3％)葡萄糖0.5-5％(或蔗糖0.5-1.0％ 或廢糖蜜0.5-7％或乳糖0.1--7％，或半乳糖0.1-7％棉籽餅粉0.1-2％(或豆餅粉0.1-8％，乳清0.1-9％，或花生餅粉0.1-8％)柑桔汁0.5-5％(或纖維二糖0.5-15％，或甘油0.1-5％，或豆油0.5-5％，或檸檬酸鈉0.1-5％)谷氨酸0.01-5％(或半胱氨酸0.01-5％，或谷氨酸+半胱氨酸0.01-5％)(NH4)2SO40.01-5％(或NH4NO30.1-7％，或NaNO30.1-7％，或氨0.1-7％)硫胺素0.001-0.5％(或玉米素0.001-0.5％)MgSO40.05-0.5％ NaCl 0.05-0.5％ FeSO40.05-0.5％ CuSO40.05-0.5％硼、鉬、鈷、鎳等微量元素(0.1-100μmol/L)本發(fā)明的發(fā)酵過程為將活化后的菌種接種于培養(yǎng)基A中，在三角瓶內搖瓶培養(yǎng)24-72小時后，以5-10％的接種量接種于已放有培養(yǎng)基B的種子罐中發(fā)酵培養(yǎng)24-60小時，然后仍按5-10％的接種量接種于三級發(fā)酵罐中進行發(fā)酵。三級發(fā)酵罐以培養(yǎng)基C作為發(fā)酵營養(yǎng)液，并于罐體中加入微孔陶瓷材料，(或微孔網膜、煤渣、聚氨酯泡沫，磚渣或海藻酸鈉，聚乙烯醇、明膠等)將菌體固定化處理。在三級發(fā)酵過程中，待菌體生長進入穩(wěn)定期時，通過降低溶解氧濃度、降低發(fā)酵溫度手段降低菌體生長速率，并連續(xù)低濃度流加培養(yǎng)基C及添加前體底物，定時定量出料。將發(fā)酵后的發(fā)酵液用有機溶劑萃取法，離子交換柱法，硅膠柱層折法及活性炭吸附法等提取后，即得白色純品脫落酸。 在發(fā)酵系統(tǒng)添加的前體底物主要有咪唑，嗎啉，吡啶及其衍生物，乙酰胺、乙酸胺，β.β-二甲酰酸，咾啉，甲羥戊酸中的任一種。 提取過程中所用的試劑為甲醇、乙醇、乙酸乙脂、丙酮、氯仿、乙醚、環(huán)乙烷，石油醚等低級醇。離子交換柱所用的樹脂為強堿陰離子樹脂，也可為大孔樹脂。發(fā)酵條件溫度10℃-40℃ PH3-12PH調控用流加氨或加入CaCO3或加入NaOH、KOH的方式進行發(fā)酵時間1-30天，前體底物添加量0.1-16％本發(fā)明的整個工藝流程見附圖  。本發(fā)明的優(yōu)點①生產菌種的產量較目前國內外報道的最高產量高3-4倍(日本專利最高為300mg/L發(fā)酵液，本菌種B.C.FD338產量為900-1200mg/L發(fā)酵液)； ②發(fā)酵系統(tǒng)采用固定化技術，避免了菌體在連續(xù)進料出料過程的流失，使產酸量穩(wěn)定；③發(fā)酵系統(tǒng)在產酸期能穩(wěn)定10-30天，從而大大提高了生產效率，降低了能耗和原料使用量，使生產成本大幅度降低。 ④關鍵前體底物的添加，促進了發(fā)酵代謝正向順利進行，大幅度提高了產量。 實施例用1000ml三角瓶10個，每瓶裝300ml培養(yǎng)基A于120℃滅菌，冷卻后，接種活化后的B.C.FD338菌孢子懸液，置于25℃-28℃溫度下的搖床上，搖瓶培養(yǎng)24-72小時。 將培養(yǎng)好的一級種子液按5％接種量接種于內裝50升培養(yǎng)基B的100立升發(fā)酵罐中，在24-28℃溫度下通氣攪拌培養(yǎng)24-60小時。 用1噸發(fā)酵罐作三級罐發(fā)酵。罐內裝培養(yǎng)基C750立升及微孔陶瓷珠(粒徑0.9-160mm3，1.0-5g/L)，用常規(guī)高壓熱蒸氣滅菌后，按5％接種量接種二級種子液，通氣攪拌48小時，然后通入氨將PH控制在4-8，降低溶解氧濃度(降低通氣量)，降低發(fā)酵溫度至10-25℃以0.01-5L/小時的速度流加培養(yǎng)基C，以0.1％-16％的比例加入甲羥戊酸，使發(fā)酵系統(tǒng)狀態(tài)穩(wěn)定，每隔10小時出料一次。將所出的液料以離子交換樹脂法回收發(fā)酵液中的產品，并用乙醇洗滌，得白色結晶狀脫落酸產品。旋光度[α]D28＝+419°。 經檢測發(fā)酵系統(tǒng)經過25天的穩(wěn)定產酸，產量可達1.2克脫落酸/升發(fā)酵液。經離子交換法回收，產品回收率達80％。 權利要求 1 用真菌發(fā)酵生產天然活性脫落酸的新方法，其特征發(fā)酵采用三級連續(xù)發(fā)酵，真菌固定化工藝。在第三級發(fā)酵過程中，通過控制營養(yǎng)成分(流加培養(yǎng)基C)、控制溶解氧濃度、溫度、PH等來穩(wěn)定產酸量，并定時定量出料。提取工藝采用有機溶劑萃取，離子交換，柱層析及吸附法。整個工藝流程見附圖。 2 按照權利要求1所述的真菌發(fā)酵生產天然活性脫落酸的方法，其特征是三級連續(xù)發(fā)酵的培養(yǎng)基分別為一級培養(yǎng)基為A，二級培養(yǎng)基為B，三級培養(yǎng)基為C，其組成為培養(yǎng)基A葡萄糖0.2-2％ 牛肉膏0.1-1％酵母膏0.1-1％甘露糖0.1-0.5％ 麥芽汁5-20％ 玉米漿0.001-0.05％(或蔗糖0.1-0.5％，鼠李糖0.1-0.5％，蛋白胨0.1-1％甘油0.1-1％， 生物素0.001-0.05％)NH4NO30.1-0.5％MgSO40.05-0.3％，KCl 0.1-0.3％K2HPO40.05-0.5％培養(yǎng)基B米糠汁20-70％(或淀粉0.5-5％，糊精0.1-2％)廢糖蜜0.5-7％(或纖維二糖0.5-5％，或乳糖0.5-5％或半乳糖0.5-5％，蔗糖0.1-3％)豆餅粉0.1-2％(或花生餅粉0.1-2％，或棉籽餅粉0.1-3％)谷氨酸 0.01-0.5％ (NH4)2SO40.01-0.8％ (或尿素0.1-1％)MgSO40.05-0.3％ KCl 0.1-0.3％ 硫胺素0.0001-0.05％培養(yǎng)基C糊精0.1-3％ 麥麩汁20-70％(或玉米粉0.1-3％)葡萄糖0.5-5％(或蔗糖0.5-1.0％ 或廢糖蜜0.5-7％或乳糖0.1--7％，或半乳糖0.1-7％棉籽餅粉0.1-2％(或豆餅粉0.1-8％，乳清0.1-9％，或花生餅粉0.1-8％)柑桔汁0.5-5％(或纖維二糖0.5-15％，或甘油0.1-5％，或豆油0.5-5％，或檸檬酸鈉0.1-5％)谷氨酸0.01-5％(或半胱氨酸0.01-5％，或谷氨酸+半胱氨酸0.01-5％)(NH4)2SO40.01-5％(或NH4NO30.1-7％，或NaNO30.1-7％，或氨0.1-7％)硫胺素0.001-0.5％(或玉米素0.001-0.5％)MgSO40.05-0.5％ NaCl 0.05-0.5％FeSO40.05-0.5％ CuSO40.05-0.5％硼、鉬、鈷、鎳等微量元素0.1-100μmol/L 3按照權利要求2所述的真菌發(fā)酵生產天然活性脫落酸的新方法，其特征是一級種子接種于二級種子，二級種子接種于三級發(fā)酵罐，其接種量均為5-10％。 4按權利要求1或2所述的真菌發(fā)酵生產天然脫落酸的新方法，其特征是用于固定真菌的材料為微孔陶瓷(或海藻酸鈉，聚乙烯醇、明膠、微孔網膜，煤渣磚渣，聚氨酯泡沫等)。 5按照權利要求3所述的真菌發(fā)酵生產天然脫落酸的新方法，其特征是三級發(fā)酵系統(tǒng)中添加的前體底物主要為咪唑，嗎啉，吡啶及其衍生物，乙酰胺，乙酸胺，β、β-二甲酰酸，咾啉，甲羥戊酸等中的任一種，添加量為0.1-16％。 6按權利要求1或5所述的真菌發(fā)酵生產脫落酸的新方法，其特征是提取工藝中，所用的洗脫劑為低級醇類。 7按權利要求2或4所述的真菌發(fā)酵生產天然脫落酸的新方法，其特征是發(fā)酵條件為溫度10℃-40℃，PH3-12，PH調控用流加氨或加入CaCO3或加入NaOH、KOH的方式進行。 全文摘要 本發(fā)明屬于用真菌發(fā)酵生產天然活性脫落酸的新方法。本法通過改造現有脫落酸菌,改變培養(yǎng)基配方,改液體批次發(fā)酵工藝為連續(xù)流加補料出料以及采取菌種固定化、添加關鍵底物使產酸量穩(wěn)定,從而大幅度提高產量,降低了能耗和原料的使用量,大幅度降低了生產成本,使工業(yè)化規(guī)模生產成為可能。 文檔編號C12P7/40GK1182798SQ9611778 公開日1998年5月27日 申請日期1996年11月18日 優(yōu)先權日1996年11月18日 發(fā)明者譚紅, 李志東, 丁立生, 彭樹林 申請人:中國科學院成都生物研究所 |
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