枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基的組分是由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氫鉀、

碳酸鈣等5種原料構(gòu)成,采用L16(45)正交表,將5種原料作為枯草芽孢桿菌培

養(yǎng)有影響的因素,通過試驗數(shù)理統(tǒng)計的直觀和理論分析,對其配方進(jìn)行優(yōu)化。試

驗結(jié)果表明,當(dāng)培養(yǎng)基的配方為無水葡萄糖3.50 g/L、蛋白胨0.83 g/L、酵

母膏0.50 g/L、磷酸二氫鉀0.35 g/L和碳酸鈣0.25 g/L,溫度(34±2)℃時,

培養(yǎng)16 h即可達(dá)到生長峰值。由于枯草芽孢桿菌光學(xué)密度(optical density,OD)

與活菌數(shù)量的關(guān)系:y=0.5182x2+1.4462x+1.9714(r=0.996343),接種的

枯草芽孢桿菌由1.9714×108cfu/mL提高到3.3124×108cfu/mL。優(yōu)化的

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基條件能有效促進(jìn)枯草芽孢桿菌生長。       

培養(yǎng)基：1L蒸餾水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化鈉+0.5g牛肉膏+20g

瓊脂，或牛肉膏蛋白胨配方(1000ml)加10g的葡萄糖。

 ph為7即可，溫度30度到37度皆可——條件不是很苛刻，比較容易培養(yǎng)。

枯草芽孢桿菌常用培養(yǎng)基配方：       

1L蒸餾水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化鈉+0.5g牛肉膏+20g瓊脂        

枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備         

1. 培養(yǎng)枯草芽孢桿菌    

取親本菌株T4412、TT2 新鮮斜面分別接一環(huán)到裝有液體完全培養(yǎng)基

(CM)的試管中，36℃振蕩培養(yǎng)14 h，各取1 mL 菌液轉(zhuǎn)接入裝有20 

mL 液體完全培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，36℃振蕩培養(yǎng) 3 h，使細(xì)

胞生長進(jìn)入對數(shù)前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其終濃度為

0.3 u/mL，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2 h。          

2. 收集細(xì)胞    

各取菌液10 mL，4000 r/min 離心10 min，棄上清液，將菌體懸浮

于磷酸緩沖液中，離心。如此洗滌兩次，將菌體懸浮10 mL SMM 中，

每mL 約含108～109 活菌為宜。          

3. 總菌數(shù)測定    

各取菌液0.5 mL，用生理鹽水稀釋，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每

稀釋度作兩個平板)、傾注完全培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)24 h 后計數(shù)。此為未經(jīng)

酶處理的總菌數(shù)。          

4. 脫壁        

二株親本菌株各取5 mL 菌懸液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶濃度為

100 ug/mL，混勻后于36℃水浴保溫處理30 min，定時取樣，鏡檢觀察

原生質(zhì)體形成情況，當(dāng)95%以上細(xì)胞變成球狀原生質(zhì)體時，用4000 r/min 

離心10 min，棄上清液，用高滲緩沖液洗滌除酶，然后將原生質(zhì)體懸浮于

5 mL 高滲緩沖液中。立即進(jìn)行剩余菌數(shù)的測定。          

5. 剩余菌數(shù)測定        

 取0.5 mL 上述原生質(zhì)體懸液，用無菌水稀釋，使原生質(zhì)體裂解死亡，取

10-2、10-3、10-4 稀釋液各0.1 mL，涂布于完全培養(yǎng)基平板上，36℃

培養(yǎng)24～48 h，生長出的菌落應(yīng)是未被酶裂解的剩余細(xì)胞。         

計算酶處理后剩余細(xì)胞數(shù)，并分別計算二親株的原生質(zhì)體形成率。原生質(zhì)體

形成率＝未經(jīng)酶處理的總菌數(shù)一酶處理后剩余細(xì)胞數(shù)。  

豆粕“20 玉米5  葡萄糖5 硫酸鎂0.05  

豆粕分30葡萄糖5 蛋白胨2 水1000