免疫共沉淀（CoIP）作為一種研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典技術被廣泛的應用于信號通路或生物學功能和機制的研究中。其主要包括兩個基本的步驟：一、利用Protein A和Protein G對抗體的特異性親和作用將抗體捕獲。二、利用抗體對抗原的特異性結(jié)合將目標蛋白及其相互作用的蛋白一起捕獲。本篇文章將介紹從抗體捕獲的角度來看Protein A Sepharose和Protein G Sepharose在免疫共沉淀實驗中的應用。

Protein A 與 Protein G各自的特點

Protein A

Protein A是金黃色葡萄球菌的表面蛋白，有5個不同的結(jié)合位點對IgG的Fc 片段具有很強的特異性親和力，一個Protein A分子至少可以結(jié)合兩個IgG分子。同時，IgA/IgM/IgE也有可能結(jié)合在Protein A上。GE的Protein A Sepharose類型非常豐富：

• Protein A：天然Protein A，無動物來源組分。
• r Protein A：重組Protein A ，C-端的Cysteine可以單一位點定向偶聯(lián)于瓊脂糖基架上，降低空間位阻，提高抗體的結(jié)合能力。
• rmp Protein A：重組Protein A是多點結(jié)合于瓊脂糖基架上，有效減少脫落。
• MabSelect SuRe：基于高流速瓊脂糖基架的超高載量并耐堿清洗的Protein A填料。

Protein G

Protein G是一種源自鏈球菌G族的細胞表面蛋白，與Protein A一樣Protein G與IgG 的Fc 區(qū)域特異性結(jié)合，不同的是Protein G還可以特異性低親和的與Fab區(qū)域結(jié)合。重組的Protein G已經(jīng)除去了與白蛋白的結(jié)合位點，減少了非特異性結(jié)合。相比于Protein A，Protein G可以廣泛、更強地結(jié)合更多類型的IgG。

兩者對于不同來源和亞型的IgG的親和力如下圖：

Immunoprecipitation Starter Pack

• 提供了nProtein A Sepharose 4 Fast Flow與Protein G Sepharose 4 Fast Flow各2ml
• 非常適合針對不同種屬來源和亞型的抗體捕獲
• 單次免疫共沉淀實驗所需抗體極少（僅需1~5ug）

在利用Protein A Sepharose和Protein G Sepharose捕獲抗體時的一些問題及建議：

實驗背景較高，出現(xiàn)非特異性雜帶

• 建議一：設置陰性對照，找出非特異性條帶出現(xiàn)的原因?？梢灾苯訉⑽刺砑涌贵w的樣品與Protein A Sepharose或Protein G Sepharose混合，如果依然出現(xiàn)雜帶，則可能該雜帶是由填料的非特異性吸附導致。我們的標準操作流程中，建議大家添加預澄清這一步，就是為了更好的降低填料的非特異性吸附。
• 建議二：在清洗液中加入低濃度的非離子型去污劑，如：Triton-X-100 或 NP-40等，降低由于疏水性引起的非特異性吸附?；蛘哌m當提高鹽濃度，以降低由靜電作用引起的非特異性吸附。
• 建議三：一般在實驗步驟中會先將抗體與樣品裂解液孵育，以使抗體可以充分捕獲目的蛋白。但有時如果抗體與Protein A Sepharose或Protein G Sepharose的親和力不高時，也可以先讓抗體與beads孵育，再去捕獲目的蛋白。

抗體的重鏈和輕鏈對于實驗結(jié)果的干擾

• 建議一：在CoIP捕獲階段和后續(xù)WB檢測階段盡量使用不同物種來源的抗體。
• 建議二：利用交聯(lián)劑將抗體交聯(lián)到Protein A Sepharose或Protein G Sepharose上，使其不被洗脫，從而不會對后續(xù)結(jié)果產(chǎn)生影響。
• 建議三：利用預活化的基架（如NHS預活化），不需要借助Protein A或Protein G，直接將目標抗體偶聯(lián)于基架上進行后續(xù)目的蛋白的捕獲，同時不受抗體種屬和亞型的影響。

快速、高通量的新型免疫共沉淀操作方式

最后，為大家介紹兩種新的免疫共沉淀的操作方式，相對于傳統(tǒng)的借助于離心管的操作方式，其更為便捷，而且避免了一些傳統(tǒng)方式中會出現(xiàn)的問題，如：離心后吸取上清時的一些操作誤差和交叉污染等。

離心柱型Protein A/Protein G HP SpinTrap

• 預裝Protein A Sepharose或Protein G Sepharose的離心小柱，因有濾膜存在，可以通過離心流穿的方式將固體與液體分開，無需用移液器吸取上清。
• 方便快捷，可以平行處理多個樣品。
• 可以搭配Protein A/G HP SpinTrap 緩沖溶液試劑盒使用，內(nèi)提供了經(jīng)典和交聯(lián)兩種免疫共沉淀所需試劑。

免疫沉淀磁珠

• 借助于磁力架便可將固液分開。
• 操作方便，并且不受樣品體積的限制。
• 由于磁珠本身帶有顏色，觀察方便。