③比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質(zhì)的k值越大。

④含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質(zhì)的k值越大。

⑤含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越強(qiáng)，對(duì)溶質(zhì)的吸附作用越大。

⑥端基封尾。在反相色譜法中，主要影響堿性化合物的峰形。

⑦幾何形狀。硅膠可分為無(wú)定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價(jià)格較便宜，缺點(diǎn)是渦流擴(kuò)散項(xiàng)及柱滲透性差；后者無(wú)此缺點(diǎn)。

⑧硅膠純度。對(duì)稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長(zhǎng)，堿性成份不拖尾。

2）氧化鋁

具有與硅膠相同的良好物理性質(zhì)，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會(huì)在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動(dòng)相中不穩(wěn)定。不過(guò)現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了在水相中穩(wěn)定的氧化鋁鍵合相，并顯示出優(yōu)秀的pH穩(wěn)定性。

3）聚合物

以高交聯(lián)度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的填料是用于普通壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無(wú)機(jī)填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質(zhì)疏水性強(qiáng)。使用任何流動(dòng)相，在整個(gè)pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，可以用NaOH或強(qiáng)堿來(lái)清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質(zhì)本質(zhì)上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強(qiáng)，但它可以通過(guò)適當(dāng)?shù)墓δ芑揎椬兂捎H水性的。這種基質(zhì)不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸堿，但也可以承受在pH13下反復(fù)沖洗。

所有聚合物基質(zhì)在流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)都會(huì)出現(xiàn)膨脹或收縮。用于HPLC的高交聯(lián)度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質(zhì)中，因?yàn)樾》肿釉诰酆衔锘|(zhì)中的傳質(zhì)比在陶瓷性基質(zhì)中慢，所以造成小分子在這種基質(zhì)中柱效低。對(duì)于大分子像蛋白質(zhì)或合成的高聚物，聚合物基質(zhì)的效能比得上陶瓷性基質(zhì)。因此，聚合物基質(zhì)廣泛用于分離大分子物質(zhì)。

2．基質(zhì)的選擇

硅膠基質(zhì)的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質(zhì)，主要用來(lái)制成分子排阻和離子交換柱。

注：+++好  ++一般  +差

二、化學(xué)鍵合固定相

將有機(jī)官能團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學(xué)鍵合相。這類固定相的突出特點(diǎn)是耐溶劑沖洗，并且可以通過(guò)改變鍵合相有機(jī)官能團(tuán)的類型來(lái)改變分離的選擇性。

1．鍵合相的性質(zhì)

目前，化學(xué)鍵合相廣泛采用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應(yīng)，形成Si-O-Si-C鍵形的單分子膜而制得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個(gè)/nm²，由于空間位阻效應(yīng)（不可能將較大的有機(jī)官能團(tuán)鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有40~50%的硅醇基未反應(yīng)。

殘余的硅醇基對(duì)鍵合相的性能有很大影響，特別是對(duì)非極性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對(duì)極性溶質(zhì)（特別是堿性化合物）產(chǎn)生次級(jí)化學(xué)吸附，從而使保留機(jī)制復(fù)雜化（使溶質(zhì)在兩相間的平衡速度減慢，降低了鍵合相填料的穩(wěn)定性。結(jié)果使堿性組分的峰形拖尾）。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應(yīng)后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等進(jìn)行鈍化處理，稱封端（或稱封尾、封頂，end-capping），以提高鍵合相的穩(wěn)定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動(dòng)相有更好的“濕潤(rùn)”性能。

由于不同生產(chǎn)廠家所用的硅膠、硅烷化試劑和反應(yīng)條件不同，因此具有相同鍵合基團(tuán)的鍵合相，其表面有機(jī)官能團(tuán)的鍵合量往往差別很大，使其產(chǎn)品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來(lái)表示，也可以用覆蓋度來(lái)表示。所謂覆蓋度是指參與反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例。

pH值對(duì)以硅膠為基質(zhì)的鍵合相的穩(wěn)定性有很大的影響，一般來(lái)說(shuō)，硅膠鍵合相應(yīng)在pH=2~8的介質(zhì)中使用。

2．鍵合相的種類

化學(xué)鍵合相按鍵合官能團(tuán)的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。

常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH₂)和二醇基(DIOL)鍵合相。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基于極性鍵合基團(tuán)與溶質(zhì)分子間的氫鍵作用，極性強(qiáng)的組分保留值較大。極性鍵合相有時(shí)也可作反相色譜的固定相。

常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18應(yīng)用最廣。非極性鍵合相的烷基鏈長(zhǎng)對(duì)樣品容量、溶質(zhì)的保留值和分離選擇性都有影響，一般來(lái)說(shuō)，樣品容量隨烷基鏈長(zhǎng)增加而增大，且長(zhǎng)鏈烷基可使溶質(zhì)的保留值增大，并常常可改善分離的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時(shí)可得到對(duì)稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質(zhì)相似。

另外C18柱穩(wěn)定性較高，這是由于長(zhǎng)的烷基鏈保護(hù)了硅膠基質(zhì)的緣故，但C18基團(tuán)空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時(shí)柱效較低。

3．固定相的選擇

分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對(duì)雙鍵異構(gòu)體或含雙鍵數(shù)不等的環(huán)狀化合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有較強(qiáng)的氫鍵結(jié)合能力，對(duì)某些多官能團(tuán)化合物如甾體、強(qiáng)心甙等有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產(chǎn)生選擇性相互作用，故被廣泛用于糖類的分析，但它不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因?yàn)樗鼈冎g會(huì)發(fā)生反應(yīng)生成Schiff 堿。二醇基鍵合相適用于分離有機(jī)酸、甾體和蛋白質(zhì)。

分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。利用特殊的反相色譜技術(shù)，例如反相離子抑制技術(shù)和反相離子對(duì)色譜法等，非極性鍵合相也可用于分離離子型或可離子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是應(yīng)用最為廣泛的非極性鍵合相，它對(duì)各種類型的化合物都有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。短鏈烷基鍵合相能用于極性化合物的分離，而苯基鍵合相適用于分離芳香化合物。

另外，美國(guó)藥典對(duì)色譜法規(guī)定較嚴(yán)，它規(guī)定了柱的長(zhǎng)度，填料的種類和粒度，填料分類也較詳細(xì)，這樣使色譜圖易于重現(xiàn)；而中國(guó)藥典僅規(guī)定填料種類，未規(guī)定柱的長(zhǎng)度和粒度，這使檢驗(yàn)人員難于重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)，在某些情況下還浪費(fèi)時(shí)間和試劑。

三、流動(dòng)相

1．流動(dòng)相的性質(zhì)要求

一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測(cè)器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。

選好填料（固定相）后，強(qiáng)溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附減少，相應(yīng)的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質(zhì)在填料表面吸附增加，相應(yīng)的容量因子k升高。因此，k值是流動(dòng)相組成的函數(shù)。塔板數(shù)N一般與流動(dòng)相的粘度成反比。所以選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面：

①流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

②純度。色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過(guò)有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。

③必須與檢測(cè)器匹配。使用UV檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)沒(méi)有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測(cè)器時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相，以提高靈敏度。

④粘度要低（應(yīng)<>）。高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會(huì)使柱壓降增加，使分離時(shí)間延長(zhǎng)。最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相。

⑤對(duì)樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會(huì)使柱子惡化。

⑥樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。

2．流動(dòng)相的選擇

在化學(xué)鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關(guān)。在正相色譜中，溶劑的強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而增加；在反相色譜中，溶劑的強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而減弱。

正相色譜的流動(dòng)相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。

反相色譜的流動(dòng)相通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調(diào)整劑的性質(zhì)及其所占比例對(duì)溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統(tǒng)已能滿足多數(shù)樣品的分離要求，且流動(dòng)相粘度小、價(jià)格低，是反相色譜最常用的流動(dòng)相。但Snyder則推薦采用乙腈-水系統(tǒng)做初始實(shí)驗(yàn)，因?yàn)榕c甲醇相比，乙腈的溶劑強(qiáng)度較高且粘度較小，并可滿足在紫外185~205nm處檢測(cè)的要求，因此，綜合來(lái)看，乙腈-水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)。

在分離含極性差別較大的多組分樣品時(shí)，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，也需采用梯度洗脫技術(shù)。

參考資料：

乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。價(jià)格是甲醇的6~7倍。

反相色譜中，如果要在相同的時(shí)間內(nèi)分離同一組樣品，甲醇/水作為沖洗劑時(shí)其沖洗強(qiáng)度配比與乙腈/水或四氫呋喃/水的沖洗強(qiáng)度配比有如下關(guān)系：

C_乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C_甲醇

C_四氫呋喃＝0.66C_甲醇

C為不同有機(jī)溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強(qiáng)度相當(dāng)于89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃/水的沖洗強(qiáng)度。

3．流動(dòng)相的pH值

采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。

4．流動(dòng)相的脫氣

HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會(huì)影響柱的分離效率，影響檢測(cè)器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無(wú)法檢測(cè)。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動(dòng)）。此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。溶解氣體還會(huì)引起溶劑pH的變化，對(duì)分離或分析結(jié)果帶來(lái)誤差。

溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會(huì)在梯度淋洗時(shí)造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測(cè)中，溶解氧在一定條件下還會(huì)引起淬滅現(xiàn)象，特別是對(duì)芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測(cè)中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更大。

除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測(cè)器的性能，也將改善在一些熒光檢測(cè)應(yīng)用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對(duì)混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對(duì)許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。

離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開(kāi)始回到溶劑中。在1~4小時(shí)內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。

在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無(wú)此缺點(diǎn)。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí)，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來(lái)。此外還有在線脫氣機(jī)。

一般說(shuō)來(lái)有機(jī)溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測(cè)時(shí)經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。

5．流動(dòng)相的濾過(guò)

所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45μm（或0.22μm）濾過(guò)，以除去雜質(zhì)微粒，色譜純?cè)噭┮膊焕猓ǔ窃跇?biāo)簽上標(biāo)明“已濾過(guò)”）。

用濾膜過(guò)濾時(shí)，特別要注意分清有機(jī)相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機(jī)相濾膜一般用于過(guò)濾有機(jī)溶劑，過(guò)濾水溶液時(shí)流速低或?yàn)V不動(dòng)。水相濾膜只能用于過(guò)濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑，否則濾膜會(huì)被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對(duì)于混合流動(dòng)相，可在混合前分別濾過(guò)，如需混合后濾過(guò)，首選有機(jī)相濾膜。現(xiàn)在已有混合型濾膜出售。

6．流動(dòng)相的貯存

流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。

磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長(zhǎng)霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過(guò)。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長(zhǎng)的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無(wú)此現(xiàn)象。

7．鹵代有機(jī)溶劑應(yīng)特別注意的問(wèn)題

鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng)。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl₄、CHCl₃等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合后，可能會(huì)反應(yīng)生成一些對(duì)不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物，這種混合流動(dòng)相應(yīng)盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH₂Cl₂）與一些反應(yīng)性有機(jī)溶劑（如乙腈）混合靜置時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶。總之，鹵代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會(huì)產(chǎn)生類似問(wèn)題。

8．HPLC用水

HPLC應(yīng)用中要求超純水，如檢測(cè)器基線的校正和反相柱的洗脫。

進(jìn)行HPLC、GC、電泳和熒光分析，或在涉及組織培養(yǎng)時(shí)，沒(méi)有有機(jī)物污染是非常重要的。測(cè)高錳酸鉀顏色保留時(shí)間的定性方法反應(yīng)慢，對(duì)很低水平的有機(jī)物（對(duì)HPLC可能還是太高了）不夠靈敏，特別是不能定量。總有機(jī)碳(TOC)分析儀（把有機(jī)物氧化成CO₂，測(cè)游離的CO₂）常用于I類（NCCLS）水中低濃度有機(jī)物的測(cè)定。

I類水標(biāo)準(zhǔn)：

美國(guó)藥典24版（2000年）要求TOC＜0.5 mg/L（用標(biāo)準(zhǔn)蔗糖溶液1.19 mg/L），電導(dǎo)率在室溫pH 6時(shí)≤2.4 μS/cm（即≥0.42 MΩ·cm）。HPLC級(jí)水增加吸收特性：在1cm池中，用超純水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分別不得過(guò)0.01、0.01和0.05。增加不揮發(fā)物，≤3ppm（中國(guó)藥典純水≤10ppm）。

V．HPLC應(yīng)用

一、樣品測(cè)定

1．流動(dòng)相比例調(diào)整：由于我國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有規(guī)定柱的長(zhǎng)度及填料的粒度，因此每次新開(kāi)檢新品種時(shí)幾乎都須調(diào)整流動(dòng)相（按經(jīng)驗(yàn)，主峰一般應(yīng)調(diào)至保留時(shí)間為6~15分鐘為宜）。所以建議第一次檢驗(yàn)時(shí)請(qǐng)少配流動(dòng)相，以免浪費(fèi)。弱電解質(zhì)的流動(dòng)相其重現(xiàn)性更不容易達(dá)到，請(qǐng)注意充分平衡柱。

2．樣品配制：①溶劑；②容器：塑料容器常含有高沸點(diǎn)的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會(huì)吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會(huì)被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時(shí)應(yīng)將玻璃容器進(jìn)行硅烷化處理。

3．記錄時(shí)間：第一次測(cè)定時(shí)，應(yīng)先將空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液各進(jìn)一針，并盡量收集較長(zhǎng)時(shí)間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數(shù)及是否還有雜質(zhì)峰在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)才洗脫出來(lái)，確定是否會(huì)影響主峰的測(cè)定。

4．進(jìn)樣量：藥品標(biāo)準(zhǔn)中常標(biāo)明注入10ml，而目前多數(shù)HPLC系統(tǒng)采用定量環(huán)（10ml、20ml和50ml），因此應(yīng)注意進(jìn)樣量是否一致。（可改變樣液濃度）

5．計(jì)算：由于有些對(duì)照品標(biāo)示含量的方式與樣品標(biāo)示量不同，有些是復(fù)合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標(biāo)示，檢驗(yàn)時(shí)請(qǐng)注意。

6．儀器的使用：

①流動(dòng)相濾過(guò)后，注意觀察有無(wú)肉眼能看到的微粒、纖維。有請(qǐng)重新濾過(guò)。

②柱在線時(shí)，增加流速應(yīng)以0.1ml/min的增量逐步進(jìn)行，一般不超過(guò)1ml/min，反之亦然。否則會(huì)使柱床下塌，叉峰。柱不線時(shí)，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率遞增上去（或下來(lái)），勿急升（降），以免泵損壞。

③安裝柱時(shí)，請(qǐng)注意流向，接口處不要留有空隙。

④樣品液請(qǐng)注意濾過(guò)（注射液可不需濾過(guò)）后進(jìn)樣，注意樣品溶劑的揮發(fā)性。

⑤測(cè)定完畢請(qǐng)用水沖柱1小時(shí)，甲醇30分鐘。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）沖洗過(guò)夜（注意水要夠量），不須沖洗甲醇。另外需要特別注意的是：對(duì)于含碳量高、封尾充分的柱，應(yīng)先用含5~10%甲醇的水沖洗，再用甲醇沖洗。

⑥沖水的同時(shí)請(qǐng)用水充分沖洗柱頭（如有自動(dòng)清洗裝置系統(tǒng)，則應(yīng)更換水）。

二、方法研究

1．波長(zhǎng)選擇：首先在可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)上測(cè)量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測(cè)量波長(zhǎng)，如最靈敏的測(cè)量波長(zhǎng)并避開(kāi)其它物質(zhì)的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應(yīng)值，如吸收度小于0.5時(shí)，HPLC測(cè)定的面積將會(huì)很小。

2．流動(dòng)相選擇：盡量采用不是弱電解質(zhì)的甲醇-水流動(dòng)相。

附件：高效液相色譜法（HPLC）復(fù)核細(xì)則

一、對(duì)起草單位的要求：

1．HPLC法用于藥品的有關(guān)物質(zhì)檢查或含量測(cè)定時(shí)，需提供建立HPLC法的依據(jù)及參考文獻(xiàn)。

2．應(yīng)對(duì)建立的方法進(jìn)行論證，按照中國(guó)藥典2000年版二部凡例與附錄收載的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證項(xiàng)下所列的要求進(jìn)行試驗(yàn)。

3．建立方法時(shí)，應(yīng)考慮下列事項(xiàng)：

①首選填料為十八烷基鍵合硅膠，并至少對(duì)兩根不同品牌的色譜柱進(jìn)行比較試驗(yàn)，其中一根為國(guó)產(chǎn)柱。

②流動(dòng)相首選甲醇-水系統(tǒng)，應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動(dòng)相，如為堿性藥物，流動(dòng)相的pH值應(yīng)為7~8；如為酸性藥物，流動(dòng)相的pH值應(yīng)為3~4。

③盡可能選用流動(dòng)相作為溶劑，如未能選用，應(yīng)說(shuō)明原因。

④內(nèi)標(biāo)物應(yīng)首選易得到的純度較高的化學(xué)試劑或?qū)φ掌?，?yīng)與待測(cè)物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，理化性質(zhì)接近，峰的響應(yīng)值相當(dāng)，以及分離度應(yīng)大于1.5，另應(yīng)考慮對(duì)照品的來(lái)源問(wèn)題。

⑤檢測(cè)器首選UV檢測(cè)器。

4．采用HPLC法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)，如雜質(zhì)峰的響應(yīng)值與主成分峰的響應(yīng)值相差太大，應(yīng)首選自身對(duì)照法，而不宜選用面積歸一化法。

5．HPLC法用于原料藥的含量測(cè)定。如以內(nèi)標(biāo)法測(cè)定含量，應(yīng)考慮內(nèi)標(biāo)物是否含有干擾供試品的雜質(zhì)；如以外標(biāo)法測(cè)定含量，對(duì)照品與供試品應(yīng)各取樣2份，對(duì)照晶溶液各進(jìn)樣3次，供試品溶液各進(jìn)樣2次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD應(yīng)不得大于l.5％）。

二、對(duì)復(fù)核單位的要求：

1．按照起草單位提供的色譜條件與方法進(jìn)行復(fù)核。

2．當(dāng)HPLC法用于有關(guān)物質(zhì)的檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行最低撿出量試驗(yàn)。

3．應(yīng)考慮對(duì)同一樣品分析結(jié)果的重現(xiàn)程度、方法的可行性，并作出評(píng)價(jià)。(下