| 【摘要】：目的研究淫羊藿苷是否通過c AMP-PKA信號通路來促進(jìn)成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)成熟礦化。方法以1×10?5 mol·L?1淫羊藿苷分別處理體外培養(yǎng)的大鼠顱骨OB細(xì)胞和人類乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)不同時間后,免疫熒光染色法檢測2種細(xì)胞內(nèi)雌激素受體(ERα)的核轉(zhuǎn)位情況。待P1代OB細(xì)胞鋪滿80%皿底后,采用1×10?5 mol·L?1的2’,3’-雙脫氧腺苷(2’,3’-dideoxyadenosine,DDA)抑制胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC),同時以1×10?5 mol·L?1淫羊藿苷分別作用于正常組和信號阻斷組不同時間后,ELISA檢測細(xì)胞內(nèi)c AMP的含量。以終濃度為1×10?6 mol·L?1蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制劑KT5720處理細(xì)胞,同時以1×10?5 mol·L?1淫羊藿苷分別作用于信號阻斷組和正常組,3 d和6 d后檢測胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性;藥物處理48 h后,Real-time PCR檢測I型膠原(collagen I,COL I)、Runx-2、ALP m RNA的表達(dá)量;Western blot檢測COL I、Runx-2蛋白表達(dá)量。結(jié)果淫羊藿苷作用于細(xì)胞4 h后,MCF-7胞內(nèi)ERα發(fā)生明顯的核轉(zhuǎn)位,而OB細(xì)胞在所有時間點(diǎn)都未檢測到明顯核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象,結(jié)合本課題組前期的淫羊藿苷雌激素比較試驗說明,淫羊藿苷促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨性分化并不主要依賴于其雌激素活性。淫羊藿苷促OB細(xì)胞后,胞內(nèi)c AMP迅速升高,處理1 h后與對照組相比具有顯著性差異。加入DDA阻斷AC后,淫羊藿苷促胞內(nèi)c AMP升高的作用消失。1×10?5 mol·L?1淫羊藿苷能夠顯著地促進(jìn)胞內(nèi)ALP的活性,成骨性分化相關(guān)的因子COL I、Runx-2和ALP的基因表達(dá)也相應(yīng)增高,同時COL I和Runx-2蛋白表達(dá)量也顯著增加。當(dāng)采用KT5720抑制PKA的活性之后,ALP活性下降,成骨性分化的指標(biāo)也隨之降低。結(jié)論淫羊藿苷促進(jìn)OB細(xì)胞成骨性分化并不主要依賴于其雌激素活性,而是通過迅速提高成骨細(xì)胞內(nèi)c AMP的含量,激活胞內(nèi)c AMP-PKA信號通路,進(jìn)而促進(jìn)成骨性相關(guān)因子的表達(dá),來促進(jìn)OB細(xì)胞成熟礦化。 |
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