編譯 | 新銳恒豐研究院（節(jié)選）

來源 | David V. Butruille等18人，密蘇里，圣路易市，孟山都公司，全球玉米育種 PlantBreeding Review, Vol. 39,1st edition

雙單倍體 Doubled Haploids

A.雙單倍體的優(yōu)勢  Benefits of Doubled Haploids

現(xiàn)代玉米育種的第一步是從現(xiàn)有父母親本，選育新自交系。需要至少自交 6代到 7 代固定基因組大部分基因，這樣新系就會停止分離。使用單倍體加倍方法，可以更快產(chǎn)生新自交系。單倍體植株只有一套單一基因及一組染色體。染色體加倍之后，形成兩套完全相同基因的染色體。所有基因都是純合。雙單系快速純合提供玉米育種一些好處。它可以縮短育種年限，所有隱性基因缺點馬上暴露，以及所有個體植株遺傳變異及缺點立即顯現(xiàn)，改善表現(xiàn)性選拔的品質(zhì)。

▲ 來源：agrigold.com

B.單倍體的產(chǎn)生 Haploid Creation

玉米跟許多其他作物一樣，可以使用組織外培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生單倍體。雖然玉米花藥及小孢子培養(yǎng)有進展，但是成功僅限于某些基因型個體。學(xué)者分析美國 4 個花培自交系，證實它們的花藥培養(yǎng)反應(yīng)的遺傳特性。基因型以及低頻率限制了組培技術(shù)在玉米育種的實際利用。

▲ 來源：TIM_CUPKA，2013 illinois corn breeder school

配子體不確定隱性基因（ig或indeterminate gametophyte）可以導(dǎo)致不正常胚囊發(fā)育以及無核卵子。使用純合的 ig 植株做母本，供體花粉做父本授粉，可以產(chǎn)生 1-3% 父本型單倍體子粒。由于單倍體細(xì)胞核來自父本，細(xì)胞質(zhì)來自母本，可以有效提供細(xì)胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)的有效轉(zhuǎn)換。不需回交很多世代，只需一代就可轉(zhuǎn)換細(xì)胞質(zhì)。然而由于效率比較低，這種雙單系育種方法，不如下列體細(xì)胞母本單細(xì)胞方法有效。

▲ 來源：TIM_CUPKA，2013 illinois corn breeder school

柯（Coe）1959 年發(fā)現(xiàn)墨西哥粉質(zhì)玉米 Stock 6，自交及作為花粉時，可以產(chǎn)生 2-3% 的單倍體。這是一個非常有效的雙單系生產(chǎn)方法，因為只需誘導(dǎo)系花粉做父本，可以在隔離苗圃（ICB或Isolated Crossing Block）與許多母本雜交。幾乎所有單倍體來自母本，具有母本供體的遺傳基因組及細(xì)胞質(zhì)。世界有許多科研單位已經(jīng)有效改良單倍體誘導(dǎo)頻率，某些誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)頻率高于 10% 。

▲ 來源：TIM_CUPKA，2013 illinois corn breeder school

誘導(dǎo)母本單倍體的機制有兩種學(xué)說。Wedzony 等的學(xué)說，認(rèn)為花粉粒的一個精細(xì)胞有缺陷。與卵核授精之后，在胚發(fā)育中，精核基因組退化而被排除。成為只有母本單倍體卵細(xì)胞及三倍體胚乳。Chalyk 等認(rèn)為一個精核沒有與卵核結(jié)合，未受精卵核直接傳達(dá)胚囊發(fā)育信息。目前有一個可以解釋 66%單倍體遺傳變異的數(shù)量性狀基因位點已經(jīng)確認(rèn)在 243kb 區(qū)域范圍內(nèi)?？梢詭椭M一步了解單倍體誘導(dǎo)機制及數(shù)量性狀基因的克隆。

C.單倍體的鑒定 Haploid Identification

最常用的單倍體鑒定是使用顯性花青素標(biāo)記 R1-nj。這個基因在顯性花青素基因 A1, A2 及 C2 存在時，使用誘導(dǎo)系花粉與正常黃色子粒受體雜交，產(chǎn)生的二倍體子粒有紫色冠頂及紫色胚芽鞘，單倍體子粒則是紫色冠頂及無色胚芽鞘。這個鑒定方法不適用于世界上少量帶有抑制 R1 花青素形成的顯性基因 C1-I, C2-Idf 及 In1-D 受體種質(zhì)。這些種質(zhì)與誘導(dǎo)系雜交后，子粒是黃色，沒有紫色冠頂及紫色胚芽鞘，不能區(qū)別二倍體及單倍體子粒。

▲ 來源：TIM_CUPKA，2013 illinois corn breeder school

此外，植株發(fā)芽早期，花青素基因 B1 及 Pl1，可以表現(xiàn)紫色胚芽尖及根尖。因此二倍體幼苗表現(xiàn)紫色，單倍體植株沒有紫色。如果誘導(dǎo)系帶有獨特的基因標(biāo)記，則可以使用分子標(biāo)記方法鑒別單倍體。子粒帶有獨特標(biāo)記是二倍體種子，如果沒有標(biāo)記，就是單倍體。然而分子標(biāo)記取樣及分析時間比較長，成本比肉眼觀察貴。好處是非常精確及具有普遍的適用性。

Geiger 等將抗殺草劑基因轉(zhuǎn)到誘導(dǎo)系上面，二倍體子代抗殺草劑，單倍體子粒則對殺草劑敏感。這個方法在大面積作業(yè)時比較費工，因為單倍體對殺草劑敏感，藥劑使用量不能太高，凋萎的單倍體幼苗需要馬上清洗藥害并移栽，在溫室保護下，慢慢恢復(fù)植株健康。因此有一定的成活率風(fēng)險。中國農(nóng)大使用子粒油分含量高低來分別二倍體及單倍體子粒。這個方法在自動化一章會討論。

D.染色體加倍 Chromosome Doubling

單倍體玉米植株的一些體細(xì)胞會經(jīng)由自然的細(xì)胞融合，細(xì)胞內(nèi)加倍，核內(nèi)有絲分裂或其他機制加倍為二倍體組織，產(chǎn)生可孕的花粉及胚囊。通常，雄花可孕程度比雌花要低，同時不同基因型的可孕程度不同。如果要產(chǎn)生可靠的雙單系，必需使用化學(xué)藥劑加倍，提高加倍頻率及加倍的一致性。

▲ 來源：Gordillo，2010 illinois corn breeder school

秋水仙素是目前最廣泛使用的染色體加倍劑。玉米單倍體染色體加倍開始并不有效，直到 1994 年 Gayen 等，以及 1997 年 Deimling 等發(fā)明切除剛發(fā)芽單倍體胚芽鞘尖端的高效方法，然后將切除尖端的幼苗，放在攝氏 18度，0.06% 秋水仙素，及 0.5% DMSO 溶液中 12 小時。處理后，幼苗用水清洗，在保護環(huán)境恢復(fù)幾天，然后移栽人移栽盒或田間。這是目前許多公司單倍體計劃使用的加倍流程。

▲ 來源：Gordillo，2010 illinois corn breeder school

秋水仙素的挑戰(zhàn)是它的毒性。某些殺草劑，比如甲基氨草靈（amiprophos-methyl），氨磺樂靈（oryzalin），戊炔草胺（pronamid），及福樂靈（trifluralin）的毒性比較低，同時可以有效阻止有絲分裂及促進玉米細(xì)胞染色體加倍。Kato 2002 年成功使用二氧化氮（nitrous oxide gas）氣體，成功加倍玉米單倍體。這些藥劑可以作為比秋水仙素廉價，安全的染色體加倍劑。雖然染色體加倍技術(shù)已經(jīng)改良，但是加倍效率仍然是玉米雙單系生產(chǎn)的主要瓶頸。使用來自花藥的單倍體組織或來自誘導(dǎo)系雜交所產(chǎn)生的單倍體胚組織，利用組培技術(shù)加倍的成功率會比較高。但是成本比較高，以及吞吐量有限。注：文章沒有說明孟山都使用的殺草劑。

E.對認(rèn)定的雙單系植株的照顧 Care of PutativeDoubled Haploid Plants

幼苗在秋水仙素等化學(xué)藥劑加倍之后，一般都很脆弱而很容易受傷。典型的操作是種植在具有最佳溫度，濕度，土壤及光線條件的保護環(huán)境（溫室或遮蔭房）的育苗盒。在移栽以前，可以讓這些脆弱幼苗恢復(fù)。同樣，組培產(chǎn)生的可能雙單系，需要移栽溫室數(shù)周，讓他們適應(yīng)自然環(huán)境之后，移栽田間。可以在田間使用遮蔭網(wǎng)來減少光線及高溫造成的損害。適當(dāng)?shù)霓r(nóng)藝管理，包括灌溉，施肥，雜草及蟲害，是保持單倍體加倍生產(chǎn)成功的關(guān)鍵。