細(xì)胞毒性T細(xì)胞穿入現(xiàn)象在原發(fā)性膽汁性膽管炎中的表現(xiàn)及意義*

卞兆連1**，陳　琳1，居林玲1，苗　琪2，馬　雄2，邵建國(guó)1，管海濤1

（1南通市第三人民醫(yī)院，南通市肝病研究所，江蘇226006；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科，上海市消化疾病研究所）

［摘　　要］目的：研究原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）中發(fā)生CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）穿入現(xiàn)象及其意義。方法：收集53例PBC患者肝穿刺標(biāo)本，采用H&E染色和免疫熒光染色方法，在光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察PBC肝組織中CTL的穿入及穿入宿主細(xì)胞的類(lèi)型，并分析與病程的關(guān)系。結(jié)果：53例PBC患者中10例（18.9%）發(fā)生淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞，15例（28.3%）發(fā)生淋巴細(xì)胞穿入膽管上皮，僅1例患者同時(shí)存在淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞。免疫熒光染色證實(shí)穿入的淋巴細(xì)胞是CD8陽(yáng)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）。早期PBC患者中4例（22.2%）、晚期PBC患者中6例（17.1%）發(fā)生CTL穿入肝細(xì)胞，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。早期PBC患者中9例（50.0%）、晚期PBC患者中6例（17.1%）發(fā)生CTL穿入膽管上皮，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.52，P＜0.05）。結(jié)論：在PBC肝組織中，CTL可穿入肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，CTL穿入膽管上皮細(xì)胞并導(dǎo)致其發(fā)生凋亡可能是PBC發(fā)病過(guò)程中膽管損傷的機(jī)制之一。

［關(guān)鍵詞］穿入現(xiàn)象；原發(fā)性膽汁性膽管炎；膽管上皮

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliarycholangitis，PBC）是一種以肝內(nèi)小葉間膽管非化膿性炎癥破壞為主要病理特征的自身免疫性肝病［1］。PBC常見(jiàn)于中老年女性，臨床主要表現(xiàn)為膽汁淤積性肝病，95%患者血清抗線粒體抗體（anti-mitochondria antibody， AMA）陽(yáng)性，隨著病程進(jìn)展可發(fā)展為肝硬化、肝癌等終末期肝病，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及壽命［1］。隨著自身抗體檢測(cè)和肝活檢等技術(shù)的廣泛開(kāi)展，我國(guó)臨床醫(yī)師對(duì)PBC認(rèn)識(shí)的不斷提高，該病的檢出率明顯上升，已經(jīng)成為我國(guó)非病毒性肝病的重要組成部分［2］。迄今為止，PBC發(fā)病機(jī)制仍未闡明，普遍認(rèn)為是環(huán)境因素作用于遺傳易感性個(gè)體，導(dǎo)致膽管上皮免疫性損傷。穿入（emperipolesis）現(xiàn)象由Humble等［3］在1956年首次提出，是指一個(gè)活細(xì)胞進(jìn)入另一個(gè)活細(xì)胞的現(xiàn)象，穿入可發(fā)生于腫瘤細(xì)胞之間、免疫細(xì)胞與腫瘤之間或者免疫細(xì)胞和正常細(xì)胞之間［4］。1978年，Sandilands等［5］研究發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞可穿入人肝細(xì)胞，后續(xù)的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)穿入現(xiàn)象可見(jiàn)于自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）、藥物性肝炎、病毒性肝炎等多種肝臟疾病［6-8］。本文收集2008～2015年在南通市第三人民醫(yī)院及上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院行肝穿刺組織病理學(xué)確診的PBC 53例患者臨床資料，著重研究PBC患者肝組織中穿入現(xiàn)象，并探討其臨床意義。

1　資料與方法

1.1　一般資料　PBC 53例患者中男性4例，女性49例，男∶女為1∶8.16，年齡29～85歲，平均52.2歲。PBC診斷參照巴黎標(biāo)準(zhǔn)［9］：（1）血清AMA陽(yáng)性，尤其是M2陽(yáng)性；（2）血清膽汁淤積酶升高（谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶及堿性磷酸酶）；（3）肝臟組織病理提示非化膿性破壞性膽管周?chē)?；以上?biāo)準(zhǔn)至少符合2條或2條以上。53例PBC患者中根據(jù)Scheuer stage評(píng)分系統(tǒng)，分為早期（Scheuer stageⅠ/Ⅱ）18例（34.0%），晚期（Scheuer stageⅢ/Ⅳ）35例（66.0%）。

1.2　蘇木素-伊紅染色法（H&E） 常規(guī)10%福爾馬林溶液固定肝穿刺標(biāo)本，浸蠟、包埋，連續(xù)切片4μm厚；二甲苯、酒精等程序脫蠟水化，隨后予以蘇木素及伊紅染液浸染，酒精梯度上行、二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封片，由病理醫(yī)師在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)。

1.3　免疫熒光染色、激光共聚焦顯微鏡下觀察　肝穿刺石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，PBS洗5min×2次；隨后予以3%H2O2室溫孵育15min，PBS洗滌5min× 3次，立即予以pH6.0檸檬酸鹽抗原修復(fù)液（微波修復(fù)10min），冷卻至室溫；PBS沖洗3次，5min/次；滴加50μL封閉血清，室溫下封閉30min；去除封閉液，滴加一抗（抗-CK8/18抗體、抗-CK7抗體和抗-CD8抗體，抗體工作濃度均為1：100；抗體及一抗稀釋液均購(gòu)于DAKO公司），置于濕盒中4℃冰箱過(guò)夜。次日PBS沖洗5min×3次，分別滴加相應(yīng)的熒光二抗（由DYLight594分別標(biāo)記抗-CK8/18抗體和抗-CK7抗體呈紅色，由FITC標(biāo)記抗-CD8抗體呈綠色，由DAPI標(biāo)記核呈藍(lán)色，1：3000稀釋?zhuān)琁nvitrogen公司）室溫孵育30min；PBS沖洗5min×3次，晾干后，滴加DAPI-Fluoromount-GTM封片，在激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss）下觀察并攝片。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理　應(yīng)用Graphpad prism 6統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，率的組間差異性比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1　PBC患者中淋巴細(xì)胞穿入的類(lèi)型　　通過(guò)觀察H&E染色的組織切片發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿入可發(fā)生于淋巴細(xì)胞與肝細(xì)胞或與膽管上皮細(xì)胞之間。淋巴細(xì)胞穿入的肝細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿疏松、腫脹，未出現(xiàn)嗜伊紅染色，提示宿主肝細(xì)胞處于腫脹變性（圖1A）。淋巴細(xì)胞穿入膽管上皮顯示為淋巴細(xì)胞與膽管上皮細(xì)胞密切接觸、部分穿入或完全穿入膽管上皮內(nèi)；同時(shí)膽管上皮細(xì)胞胞漿發(fā)生嗜伊紅染色，細(xì)胞固縮，提示膽管上皮細(xì)胞發(fā)生早期凋亡（圖1B、1C、1D）。

圖1　PBC患者肝內(nèi)穿入現(xiàn)象（400×）

A：淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞；B：淋巴細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞接觸；C和D：淋巴細(xì)胞穿入膽管上皮細(xì)胞內(nèi)。

53例PBC患者中10例（18.9%）發(fā)生淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞，15例（28.3%）發(fā)生淋巴細(xì)胞穿入膽管上皮，提示在PBC中淋巴細(xì)胞穿入膽管上皮更為常見(jiàn)。僅1例患者同時(shí)存在淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞。免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡下證實(shí)PBC病變組織中穿入的淋巴細(xì)胞是CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞，即為細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），圖2A，圖2B。

圖2　激光共聚焦顯微鏡下顯示CTL穿入肝細(xì)胞（A）和膽管上皮（B）（600×）

A：CK8/18標(biāo)記的肝細(xì)胞（紅色）和CD8標(biāo)記的CTL（綠色），DAPI標(biāo)記核呈藍(lán)色；B：CK7標(biāo)記的膽管上皮（紅色）和CD8標(biāo)記的CTL（綠色），DAPI標(biāo)記核呈藍(lán)色。

2.2　不同病程CTL穿入發(fā)生率的比較　CTL穿入肝細(xì)胞的發(fā)生率，早期PBC患者中4例（22.2%），晚期PBC患者中6例（17.1%），兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CTL穿入膽管上皮的發(fā)生率，早期PBC患者中9例（50.0%），晚期PBC患者中6例（17.1%），兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.52，P＜0.05）。

3　討　論

已知PBC的發(fā)病與環(huán)境因素以及遺傳易感性密切相關(guān)，遺傳易感性個(gè)體在環(huán)境因素的作用下，出現(xiàn)針對(duì)自身抗原的免疫細(xì)胞，引起肝內(nèi)小膽管的免疫性損傷［10］。有研究顯示，肝內(nèi)小葉間膽管是PBC累及的主要部位，膽管上皮細(xì)胞凋亡是PBC重要的病理特征之一，具體何種機(jī)制導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞凋亡仍未完全闡明［11］。

研究認(rèn)為PBC發(fā)病基礎(chǔ)是機(jī)體免疫耐受被打破，自身反應(yīng)性T細(xì)胞在肝臟局部聚集，造成器官特異性的自身免疫性肝病。在PBC中，異常的免疫細(xì)胞主要包括效應(yīng)T細(xì)胞、B細(xì)胞等，主要攻擊膽管上皮細(xì)胞，導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞損害，最終發(fā)生以小膽管損傷為主要特征的非化膿性膽管周?chē)?span>［12］。研究顯示，PBC發(fā)病機(jī)制中的免疫紊亂主要涉及肝內(nèi)Th1、Th2、Th17免疫平衡紊亂，導(dǎo)致自身反應(yīng)的異常淋巴細(xì)胞在肝內(nèi)聚集；另外，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞同樣在PBC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，主要通過(guò)抑制效應(yīng)T細(xì)胞功能及分泌炎癥因子等途徑，參與疾病的發(fā)病過(guò)程［13］。美國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)小鼠肝細(xì)胞可通過(guò)穿入機(jī)制清除自身反應(yīng)性CD8陽(yáng)性T細(xì)胞；而自身反應(yīng)性CD8陽(yáng)性T細(xì)胞回輸給小鼠后，在肝內(nèi)迅速被清除，不會(huì)引起肝內(nèi)炎癥，主要是通過(guò)淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞這一機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)［14］。

1956年，Humble等［3］研究發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞可以進(jìn)入其他體外培養(yǎng)的細(xì)胞，并提出了細(xì)胞穿入的概念。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞可穿入多種細(xì)胞，主要包括成纖維細(xì)胞、巨核細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞［15-17］。Sandilands等［5］發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的張氏肝細(xì)胞可被淋巴細(xì)胞穿入。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)多種淋巴細(xì)胞，如人T淋巴瘤細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞等均可穿入肝細(xì)胞［18］。AIH、病毒性肝炎和藥物性肝損傷患者肝組織中均存在穿入現(xiàn)象，尤其在AIH中特別明顯，是AIH的特征性病理表現(xiàn)［6-8］。Miao等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在AIH中穿入現(xiàn)象主要發(fā)生在淋巴細(xì)胞與肝細(xì)胞之間。本文結(jié)果顯示，在PBC患者中同樣存在穿入現(xiàn)象，而且穿入現(xiàn)象不僅發(fā)生在淋巴細(xì)胞與肝細(xì)胞之間，也發(fā)生在淋巴細(xì)胞與膽管上皮之間，免疫熒光染色證實(shí)穿入的淋巴細(xì)胞是CD8陽(yáng)性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）。說(shuō)明穿入的CTL可通過(guò)細(xì)胞毒作用發(fā)揮殺傷膽管上皮的作用，促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致膽管損傷，這可能是PBC發(fā)病過(guò)程中膽管上皮細(xì)胞損害的機(jī)制之一。進(jìn)一步研究顯示，CTL穿入肝細(xì)胞現(xiàn)象與PBC病程無(wú)明顯相關(guān)性，而CTL穿入膽管上皮與病程明顯相關(guān)，隨著疾病病程進(jìn)展，CTL穿入膽管上皮現(xiàn)象明顯減少。這可能與疾病后期肝纖維化明顯加重，膽管炎反而減輕，以及在疾病后期常常合并膽管消失等有關(guān)。本研究提示在PBC的發(fā)生發(fā)展中，CTL穿入膽管上皮細(xì)胞可能更為重要。

綜上所述，PBC中既存在CTL穿入肝細(xì)胞，也存在CTL穿入膽管上皮，其中以CTL穿入膽管上皮為主，可誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞凋亡，參與PBC發(fā)病過(guò)程中的膽管損害，并與疾病病程明顯相關(guān)。

［參考文獻(xiàn)］

［1］Carey EJ，Ali AH，Lindor KD.Primary biliary cirrhosis［J］. Lancet，2015，386（10003）：1565-1575.

［2］Wang FS，F(xiàn)an JG，Zhang Z，et al.The global burden of liver disease：the major impact of China［J］.Hepatology，2014，60（6）：2099-2108.

［3］Humble JG，Jayne WH，Pulvertaft RJ.Biological interaction between lymphocytes and other cells［J］.Br J Haematol，1956，2（3）：283-294.

［4］Overholtzer M，Brugge JS.The cell biology of cell-in-cell structures［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（10）：796-809.

［5］Sandilands GP，Reid FM，Gray KG，et al.Lymphocyte emperipolesis revisited.I.Development of in vitro assay and preliminary characterisation of the lymphocyte subpopulation involved［J］.Immunology，1978，35（2）：381-389.

［6］Dienes HP.Viral and autoimmune hepatitis.Morphologic and pathogenetic aspects of cell damage in hepatitis with potential chronicity［J］.Veroff Pathol，1989，132：1-107.

［7］Hennes EM，Zeniya M，Czaja AJ，et al.Simplified criteria for the diagnosis of autoimmune hepatitis［J］.Hepatology，2008，48（1）：169-176.

［8］Suzuki A，Brunt EM，Kleiner DE，et al.The use of liver biopsy evaluation in discrimination of idiopathic autoimmune hepatitis versus drug-induced liver injury［J］.Hepatology， 2011，54（3）：931-939.

［9］Bunchorntavakul C，Reddy KR.Diagnosis and management of overlap syndromes［J］.Clin Liver Dis，2015，19（1）：81-97.

［10］Corpechot C，Gaouar F，Chrétien Y，et al.Smoking as an Independent risk factor of liver fibrosis in primary biliary cirrhosis［J］.J Hepatol，2012，56（1）：218-224.

［11］Tang R，Chen H，Miao Q，et al.The cumulative effects of known susceptibility variants to predict primary biliary cirrhosis risk［J］.Genes Immun，2015，16（3）：193-198.

［12］Hirschfield GM，Gershwin ME.The immunobiology and pathophysiology of primary biliary cirrhosis［J］.Annu Rev Pathol，2013，8（8）：303-330.

［13］You Z，Wang Q，Bian Z，et al.The immunopathology of liver granulomas in primary biliary cirrhosis［J］.J Autoimmun，2012，39（3）：216-221.

［14］Benseler V，Warren A，Vo M，et al.Hepatocyte entry leads to degradation of autoreactive CD8 T cells［J］.Proc Natl A－cad Sci U S A，2011，108（40）：16735-16740.

［15］Larsen TE.Emperipolesis of granular leukocytes within megakaryocytes in human hemopoietic bone marrow［J］. Am J Clin Pathol，1970，53（4）：485-489.

［16］Sinkovics Jg SC，Howe CD.Cell destruction by lymphocytes［J］.Lancet，1966，287：1215-1216.

［17］Saxena S，Beena KR，Bansal A，et al.Emperipolesis in a common breast malignancy.A case report［J］.ActaCytol，2002，46（5）：883-886.

［18］Chen YH，Wang S，He MF，et al.Prevalence of heterotypic tumor/immune cell-in-cell structure in vitro and in vivo leading to formation of aneuploidy［J］.PLoS One，2013，8（3）：e59418.

［19］Miao Q，Bian Z，Tang R，et al.Emperipolesis mediated by CD8 T cells is a characteristic histopathologic feature of autoimmune hepatitis［J］.Clin Rev Allergy Immunol，2015，48（2/3）：226-235.

Explore the features and significance of cytotoxic T lymphocytes emperipolesis in primary biliary cholangitis

BIAN Zhaolian1，CHEN Lin1，JU Linlin1，MIAO Qi2，MA Xiong2，SHAO Jianguo1，GUAN Haitao1
（1Nantong Third People's Hospital，Nantong Institute of Liver Disease，Jiangsu 226006；2Division of Gastroenterology and Hepatology，Renji Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai Institute of Digestive Disease）

［Abstract］Objective：To explore the features of CD8 positive cytotoxic T lymphocytes（CTL）emperipolesis and its correlation with course of disease in primary biliary cholangitis（PBC）.Methods：H&E staining was used to determine the phenotype of emperipolesis in PBC.In immunofluorescence，CK8/18 was the marker of hepatocytes，while CK7 was used to mark cholangiocyte，and CD8 was the marker of CTL；Phenotypes of emperipolesis were observed under optical and laser confocal microscopes；And analyzed the correlation between emperipolesis and disease progression.Results：Two kinds of emperipolesis were observed in PBC，one is‘CTL into hepatocyte'，another is‘CTL into cholangiocyte'.Negative correlation between‘CTL into cholangiocyte'and course of disease was found.‘CTL entry into cholangiocyte'lead to apoptosis of cholangiocyte.Conclusion：Both‘CTL into hepatocyte'and‘CTL into cholangiocyte'were observed in PBC，and apoptosis of cholangiocyte induced by‘CTL into cholangiocyte'may be a mechanism of bile duct damage in PBC.

［Key words］emperipolesis；primary biliary cholangitis；cholangiocyte

［中圖分類(lèi)號(hào)］R575.7　　

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號(hào)］1006-2440（2016）04-0307-04

*［基金項(xiàng)目］南通市科技局資助項(xiàng)目（MS22015105，HS2014061，BK2014073）；江蘇省科技廳資助項(xiàng)目（BK2016420）。

**［作者簡(jiǎn)介］卞兆連，男，江蘇鹽城人，生于1984年2月，博士，主治醫(yī)師。研究方向：慢性肝病免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。　　通信作者：管海濤，E-mail：nantonghaitao@163.com

［收稿日期］2016-07-14