樣本聚類(lèi)：flashClust包提供了一種比hclust()較快的聚類(lèi)方法，比如sampleTree = flashClust(dist(datExpr0), method = "average")。也可以直接使用plotClusterTreeSamples()直接查看樣本聚類(lèi)情況，如下圖，y表示樣本的一個(gè)分類(lèi)，比如正常組和對(duì)照組。

注意：datExpr0中行代表樣本，而列代表基因。

WGCNA包對(duì)芯片數(shù)據(jù)有特殊的處理習(xí)慣，即將芯片數(shù)據(jù)矩陣的行表示為樣本，列表示基因。所以N×M矩陣，表示N個(gè)樣本，M個(gè)基因。正因如此，如果使用函數(shù)dist(exprData)可以得到按照樣本（即“按行聚類(lèi)”）的聚類(lèi)結(jié)果。

使用函數(shù)pickSoftThreshold(datExpr, powerVector = powers, networkType = 'unsigned', verbose = 5)。其中，dataExpr的行列要求與上相同；powerVector可以是一系列數(shù)值，從而選擇最優(yōu)值；networkType可以選擇unsigned（無(wú)向？）或者signed（有向？）；默認(rèn)Rsquared閥值是0.85。

這個(gè)函數(shù)返回一個(gè)列表，第一項(xiàng)是powerEstimate是估計(jì)的最優(yōu)power；第二項(xiàng)是fitIndices是詳細(xì)的矩陣數(shù)據(jù)，其中第五列是mean.k表示平均“連接度（connectivity）”。連接度是指某個(gè)基因與該網(wǎng)絡(luò)中其他基因的相關(guān)程度，常為“相關(guān)度”之和。

使用函數(shù)blockwiseModules()自動(dòng)構(gòu)建不同module。這個(gè)函數(shù)有大量的參數(shù)可供調(diào)試，比較重要的有：maxBlockSize默認(rèn)為5000，表示在這個(gè)數(shù)值內(nèi)的基因?qū)⒄w被計(jì)算，如果調(diào)大需要更多的內(nèi)存；power是軟閥值；deepSplit是分割靈敏度，取值在0到4（最靈敏）之間，默認(rèn)是2；minModuleSize設(shè)定每個(gè)modle的對(duì)小容量（即節(jié)點(diǎn)數(shù)），可以調(diào)大；numericLabels默認(rèn)為FALSE返回顏色，設(shè)定為T(mén)RUE則返回?cái)?shù)字；mergeCutHeight是在計(jì)算完所有modules后，將特征量高度相似的modules進(jìn)行和并，和并的標(biāo)準(zhǔn)就是所有小與mergeCutHeight數(shù)值，默認(rèn)為0.15，可以調(diào)大（即減少module）；pamRespectsDendro邏輯值，默認(rèn)為T(mén)RUE，可以設(shè)定為FALSE。

返回結(jié)果是一個(gè)列表，第一個(gè)colors表示基因被分為不同的module，0表示沒(méi)有任何module接受，可以使用table()函數(shù)查看，如果返回的是數(shù)字，可以使用labels2colors()轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)顏色；MEs是一個(gè)關(guān)于modules的特征量矩陣，行數(shù)等于篩選的modules數(shù)，列數(shù)等于樣本數(shù)；dendrograms表示在一個(gè)block中所有基因的進(jìn)化樹(shù)圖

也可以分步構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。1. 計(jì)算每個(gè)基因之間的“相關(guān)度（adjacency）矩陣”，使用函數(shù)adjacency()，返回N×N的矩陣，N表示所有基因數(shù)。同時(shí)，可以計(jì)算每個(gè)基因的連接度（即colSums()），之后使用scaleFreePlot()查看連接度，并且判斷網(wǎng)絡(luò)是否屬于“無(wú)標(biāo)度拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)(scale free topology)”。因?yàn)闊o(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)的連接度有冪律分布，因此scaleFreePlot()會(huì)呈現(xiàn)線性。2. 計(jì)算TOM(Topological Overlap Matrix)，使用函數(shù)TOM=TOMsimilarity()計(jì)算相似矩陣，使用TOMdist()計(jì)算不相似矩陣（即1-TOM）。3. 構(gòu)建基因進(jìn)化樹(shù)，使用函數(shù)flashClust()，使用plot()函數(shù)查看進(jìn)化樹(shù)，hang參數(shù)調(diào)整分枝度，hang越小，樹(shù)枝越少；進(jìn)化樹(shù)的每一個(gè)樹(shù)枝代表一個(gè)基因。4.使用dynamicTreeCut包修剪樹(shù)枝，使用函數(shù)cutreeDynamic()，參數(shù)與blockwiseModules()相似。也可以使用cutreeStaticColor()修剪樹(shù)枝。兩種方法各有利弊，可以根據(jù)生物學(xué)意義選擇。 5. 和并相似的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，這個(gè)過(guò)程相對(duì)于把上一步篩選得到的modules再進(jìn)行聚類(lèi)，使用函數(shù)moduleEigengenes()，確定修剪高度后，使用mergeCloseModules()函數(shù)和并modules。

使用函數(shù)plotDendroAndColors()查看系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)；blockGenes是一個(gè)block中所有的基因。dendro表示進(jìn)化樹(shù)；而colors表示modules的顏色，如果需要表示不同的modules對(duì)比，只需要把colors進(jìn)行和并cbind()即可。這將有利于展示不同的module劃分方法，并且有助于選擇modules。

通常我們會(huì)得到多個(gè)module，這時(shí)需要結(jié)合其他生物學(xué)信息選擇合適的模型。“基因顯著參數(shù)（Gene Significance, GS）”為非負(fù)數(shù)字信息，比如基于樣本的臨床數(shù)據(jù)（clinical trails）和基于每個(gè)基因的

-log(p-value)等。

樣本信息應(yīng)該是一個(gè)非負(fù)矩陣，行數(shù)等于樣本數(shù)。具體步驟：1. 計(jì)算模型特征矩陣和樣本信息矩陣的相關(guān)度，使用函數(shù)cor()，方法可以選擇Pearson。矩陣中的數(shù)值范圍是(-1,1)，越接近于-1表示負(fù)相關(guān)，越接近于1表示正相關(guān)，說(shuō)接近于0表示相關(guān)性最弱。2. 計(jì)算相關(guān)度的p值，使用函數(shù)corPvalueStudent(cor, nSamples),p值的越小表示相關(guān)性越顯著。之后，可以使用labeledHeatmap()將模型和上述相關(guān)矩陣可視化，比如下圖。從下圖可以看出與weight相關(guān)的modules中，棕色（相關(guān)性最強(qiáng)），其次是紅色、肉色和藍(lán)色。所以，如果以weight為指標(biāo)，我們可以選擇這四個(gè)modules作為下一步研究對(duì)象。

第一步，計(jì)算模型與樣本信息相關(guān)矩陣時(shí)候，模型矩陣與樣本信息矩陣的行應(yīng)該相同。比如，模型矩陣是K×P（K個(gè)樣本，P個(gè)模型），樣本信息矩陣則為K×Q（K個(gè)樣本，Q個(gè)樣本信息）。最后得到一個(gè)P×Q的矩陣。

在選定module后，還可以看這個(gè)module的特征向量與樣本信息內(nèi)，在考慮到每個(gè)基因?qū)用嫔系南嚓P(guān)性。步驟如下：1. 計(jì)算全表達(dá)譜矩陣與特征向量矩陣相關(guān)性。2. 計(jì)算全基因表達(dá)譜與樣本信息相關(guān)性。3. 使用verboseScatterplot()繪制相關(guān)性圖，如下。

還可以將樣本信息與module特征向量矩陣結(jié)合在一起（直接cbind()在一起即可），使用plotEigengeneNetworks()查看，如下圖。也可以控制plotHeatmaps參數(shù)和plotDendrograms參數(shù)分別輸出上下兩個(gè)圖。

同樣，也可以結(jié)合每個(gè)基因信息篩選合適的module。比如，經(jīng)過(guò)多重假設(shè)檢驗(yàn)計(jì)算得到的p值（可以轉(zhuǎn)換為-log(p-value)）、矯正后的q值、在某條生物學(xué)通路中（GO分類(lèi)、細(xì)胞位置、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等）的基因（0表示存在，1表示即不存在）等等。使用plotModuleSignificance(GS, modulecolor)函數(shù)作出條形圖，這個(gè)條形圖的縱坐標(biāo)的實(shí)質(zhì)就是，基因在每個(gè)模型中對(duì)應(yīng)GS的均值。下圖表示了每個(gè)基因的p值經(jīng)過(guò)處理后，對(duì)應(yīng)module的GS均值。在這種情況下，我們可以?xún)?yōu)先考慮研究綠色的module。

與此同時(shí)，還可以使用得到網(wǎng)絡(luò)根據(jù)GS篩選基因，networkScreening()篩選樣本信息相關(guān)的基因，networkScreeningGS()篩選基因信息相關(guān)的基因。

在得到每個(gè)module后，相當(dāng)于將基因做了分類(lèi)（對(duì)于每個(gè)module，類(lèi)似于找到的一部分基因）。那么，就可以使用類(lèi)似的GO、生物學(xué)通路等等分析，進(jìn)而解釋每一個(gè)module的生物學(xué)意義。

TOM圖是指基因和篩選模型的可視化表示。生成TOM圖的步驟：1. 生成全基因不相似TOM矩陣，比如1-TOMsimilarityFromExpr(datExpr, power = 6)，可以把得到的不相關(guān)矩陣加冪，這樣繪制的TOM圖色彩差異會(huì)比較明顯。2. 使用TOMplot()繪制TOM圖，如下圖。圖上和圖左是全基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，不同顏色亮帶表示不同的module，每一個(gè)亮點(diǎn)表示每個(gè)基因與其他基因的相關(guān)性強(qiáng)弱（越亮表示相關(guān)性越強(qiáng)）。 

查看生成的網(wǎng)絡(luò)：可以使用VisANT：http://visant./查看篩選的網(wǎng)絡(luò)。先生成網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，使用函數(shù)TOMsimilarityFromExpr()；之后，篩選特定的module，形成一個(gè)M×M的矩陣，表示這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中有M個(gè)節(jié)點(diǎn)（node）；最后，使用exportNetworkToVisANT()函數(shù)生成visant的輸入類(lèi)型文件，即choose(M,2)個(gè)“邊（edge）”。也可以使用exportNetworkToCytoscape()函數(shù)，生成Cytoscapte類(lèi)型的輸入數(shù)據(jù)。