一、離子色譜法

離子色譜分離的原理是基于離子交換樹脂上可離解的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)，離子之間進(jìn)行的可逆交換和分析物溶質(zhì)對交換劑親和力的差別而被分離。適用于親水性陰、陽離子的分離。離子色譜儀分離測定常見的陰離子是它的專長，一針樣品打進(jìn)去，約在20分鐘以內(nèi)就可得到7個常見離子的測定結(jié)果，這是其他分析手段所無法達(dá)到的，關(guān)于陽離子的測定離子色譜法與AAS和ICP法相比則未顯示出優(yōu)越性。

離子色譜儀包括離子交換柱和電導(dǎo)檢測，離子交換柱需經(jīng)過0.036mol/L硫酸再生液和高純水處理，洗脫液為17.5mol/L碳酸鈉和3.5mmol/L碳酸氫鈉配制而成。經(jīng)常檢測的常見離子有：

陰離子：F^-, Cl^-, Br^-, NO^2-,PO4^3-, NO^3-, SO4^2-，甲酸，乙酸，草酸等。

陽離子：Lⁱ⁺, Na⁺, NH₄⁺, K⁺,Ca²⁺, Mg²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺,Fe³⁺等。

樣品處理：先將24小時尿標(biāo)本以30ml,6mol/L濃鹽酸處理，使其pH 為1.0-2.5。取部分樣本，用高純水以20：1 比例稀釋，裝于注射器中，以0.2μm 有機系微孔濾膜過濾以清除可能阻塞的離子交換柱的雜質(zhì)，每次推注2ml。標(biāo)本經(jīng)過離子交換柱的分離和濃集后進(jìn)入分析程序。

取10μg/L濃度的溴酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述條件下重復(fù)進(jìn)樣9次，計算其的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。草酸離子的保留時間、峰高、峰面積的RSD分別為：0．20％,0.69％,0.63％。該方法的線性范圍為0.1-1.0mg/L，平均回收率為96.5%-105.2%，CV=3.1%，其檢測下限濃度為1.0μg/L，日內(nèi)和日間精密度RSD＜6.1%.張澤的研究發(fā)現(xiàn)，其最小檢測值為0.04ppm，RSD＜1.5%。該法操作簡單，檢測精度高，可以批量檢測，同時可以測定尿液枸櫞酸。

二、 高效液相色譜法

樣品處理：先將24 小時尿標(biāo)本以30ml 6mol/L 濃鹽酸，使其PH 為1.0-2.5。然后以0.22mm孔徑有機濾過膜濾過。取續(xù)濾液0.5ml，加入25mg 磺基水楊酸溶解，混勻，4℃放置30min后，12000r/min離心10min，取清亮尿液供作樣本，再以0.45μm 聚丙烯濾膜過，即可進(jìn)樣測定。測定色譜條件為：檢測波長210nm，反相C18 色譜柱，流動相為0.25%磷酸二氫鉀（含0.0025mmol/L 四丁基硫酸氫銨，硼酸調(diào)PH至2.0）。測定草酸和枸櫞酸的濃度范圍分別為0.0-4.0mmol/L和0.0-16mmol/L，最低定量限為0.2μmol/L 和1.0μmol/L，回收率為97%和102%，日內(nèi)和日間精密度RSD＜4.0%。該法的優(yōu)點也是可以同時測定尿液中草酸和枸櫞酸。

三、毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)又叫高效毛細(xì)管電泳(HPCE),是近年來發(fā)展最快的分析方法之一，是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間滴度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm內(nèi)徑毛細(xì)管柱內(nèi)用高電壓進(jìn)行分離,創(chuàng)立了現(xiàn)代毛細(xì)管電泳。1984年Terabe等建立了膠束毛細(xì)管電動力學(xué)色譜。1987年Hjerten建立了毛細(xì)管等電聚焦,Cohen和Karger提出了毛細(xì)管凝膠電泳。1988～1989年離相結(jié)合的產(chǎn)物。CE和高效液相色譜法(HPLC)相比,其相同處在于都是高效分離技術(shù),儀器操作均可自動化,且二者均有多種不同分離模式。二者之間的差異在于：CE用遷移時間取代HPLC中的保留時間,CE的分析時間通常不超過30min,比HPLC速度快；對CE而言,從理論上推得其理論塔板高度和溶質(zhì)的擴散系數(shù)成正比。檢測器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外,其它類型檢測器均已和CE實現(xiàn)了連接檢測；一般電泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自動化程度比普通電泳要高得多?？傊?/span>,CE的優(yōu)點可概括為三高二少：高靈敏度,常用紫外檢測器的檢測限可達(dá)10-13～10-15mol,激光誘導(dǎo)熒光檢測器則達(dá)10-19～10-21mol；高分辨率,其每米理論塔白質(zhì),1.7min分離19種陽離子,3min內(nèi)分離30種陰離子；成本低,只需少量(幾毫升)流動相和價格低廉的毛細(xì)管。由于以上優(yōu)點以及分離生物大分子的能力,使CE成為近年來發(fā)展最迅速的分離分析方法之一。

CE和高效液相色譜法(HPLC)相比,其相同處在于都是高效分離技術(shù),儀器操作均可自動化,且二者均有多種不同分離模式。二者之間的差異在于：CE用遷移時間取代HPLC中的保留時間,CE的分析時間通常不超過30min,比HPLC速度快；對CE而言,從理論上推得其理論塔板高度和溶質(zhì)的擴散系數(shù)成正比,對擴散系數(shù)小的生物大分子而言,其柱效就要比HPLC高得多；CE所需樣品為nl級,最低可達(dá)270fl,流動相用量也只需幾毫升,而HPLC所需樣品為μl級,流動相則需幾百毫升乃至更多；但CE僅能實現(xiàn)微量制備,而HPLC可作常量制備。

樣品處理：24 小時尿液中加入30ml 6mol/L 鹽酸防腐，硼酸調(diào)節(jié)尿液PH1.5-2.5，無法立即測定的樣本保存于4℃，測定前50-60℃水浴10min溶解草酸結(jié)晶，分析前以去離子水稀釋100 倍。測定條件使用聚胺覆膜的熔融硅膠毛細(xì)管作為載體，汞燈254nm 檢測，電解液含130mg/L 氯化鈉，22mg/L 硫酸鈉，155mg/L磷酸。本法回收率為94%-101%，日間和日內(nèi)RSD＜5.6%。

四、酶法

酶分析法是一種生物藥物分析方法。酶分析法在生物藥物分析中的應(yīng)用主要有兩個方面：①以酶為分析對象，根據(jù)需要對生物藥物生產(chǎn)過程中所使用的酶和生物藥物樣品所含的酶進(jìn)行酶的含量或酶活力的測定，稱為酶分析法；②利用酶的特點，以酶作為分析工具或分析試劑，用于測定生物藥物樣品中用一般化學(xué)方法難于儉測的物質(zhì)，如底物、輔酶、抑制劑和激動劑(活化劑)或輔助因子含量的方法稱為酶法分析。

酶是一種專一性強、催化效率高的生物催化劑。利用酶的這些特點來進(jìn)行分析的酶法分析，與其他分析方法相比有許多獨特的優(yōu)點。當(dāng)待測樣品中含有結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與待測物十分相似(如同分異構(gòu)體)的共存物時，要找到被測物特有的特征性質(zhì)或者要將被測物分離純化出來，往往非常困難。而如果有僅作用于被測物質(zhì)的酶，利用酶的特異性，不需要分離就能辨別試樣中的被測組分，從而對被測物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。所以，酶法分析常用于復(fù)雜組分中結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)比較相近的同類物質(zhì)的分離簽定和分析，而且樣品一般不需要進(jìn)行很復(fù)雜的預(yù)處理。酶法分析具有特異性強，干擾少，操作簡便，樣品和試劑用量少，測定快速精確，靈敏度高等特點。通過了解酶對底物的特異性，可以預(yù)料可能發(fā)生的干擾反應(yīng)并設(shè)法糾正。在以酶作分析試劑測定非酶物質(zhì)時，也可用偶聯(lián)反應(yīng)，而且偶聯(lián)反應(yīng)的特異性，可以增加反應(yīng)全過程的持異性。此外，由于酶反應(yīng)一般在溫和的條件下進(jìn)行，不需使用強酸強堿，它還是一種無污染或污染很少的分析方法。很多需紅使用氣相色譜儀、高壓液相色譜儀等貴重的大型精密分析儀器才能完成的分析檢驗工作，應(yīng)用酶法分析方法即可簡便快速地進(jìn)行。

樣品處理：24小時尿液樣品加入30ml 濃鹽酸，酸化尿液PH至1.0-2.0，取10ml 尿液以10mmol/L EDTA 稀釋至PH5.0。取1ml 稀釋尿液，加入300mg 活性碳后行低速離心，取上清液0.05ml 進(jìn)行酶試劑反應(yīng)，反應(yīng)液于590nm 測定吸光度。測定試劑中的草酸氧化酶能氧化草酸生成過氧化氫和二氧化碳，過氧化物酶對生成的過氧化氫進(jìn)行定量，從而計算出草酸的量。該法線性范圍為0-2.0mmol/L，精密度RSD＜2.18%，平均回收率100.5%。

五、比色法

比色法(colorimetry)是通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。早在公元初古希臘人就曾用五倍子溶液測定醋中的鐵。1795年，俄國人也用五倍子的酒精溶液測定礦泉水中的鐵。但是，比色法作為一種定量分析的方法，大約開始于19世紀(jì)30～40年代，以生成有色化合物的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。比色法作為一種定量分析的方法，開始于19世紀(jì)30～40年代。比色分析對顯色反應(yīng)的基本要求是：反應(yīng)應(yīng)具有較高的靈敏度和選擇性，反應(yīng)生成的有色化合物的組成恒定且較穩(wěn)定，它和顯色劑的顏色差別較大。選擇適當(dāng)?shù)娘@色反應(yīng)和控制好適宜的反應(yīng)條件，是比色分析的關(guān)鍵。

常用的比色法有兩種：目視比色法和光電比色法，兩種方法都是以朗伯-比爾定律(A=εbc)為基礎(chǔ)。常用的目視比色法是標(biāo)準(zhǔn)系列法，即用不同量的待測物標(biāo)準(zhǔn)溶液在完全相同的一組比色管中，先按分析步驟顯色，配成顏色逐漸遞變的標(biāo)準(zhǔn)色階。試樣溶液也在完全相同條件下顯色，和標(biāo)準(zhǔn)色階作比較，目視找出色澤最相近的那一份標(biāo)準(zhǔn)，由其中所含標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，計算確定試樣中待測組分的含量。光電比色法是在光電比色計上測量一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，將吸光度對濃度作圖，繪制工作曲線，然后根據(jù)待測組分溶液的吸光度在工作曲線上查得其濃度或含量。與目視比色法相比，光電比色法消除了主觀誤差，提高了測量準(zhǔn)確度，而且可以通過選擇濾光片來消除干擾，從而提高了選擇性。但光電比色計采用鎢燈光源和濾光片，只適用于可見光譜區(qū)和只能得到一定波長范圍的復(fù)合光，而不是單色光束，還有其它一些局限，使它無論在測量的準(zhǔn)確度、靈敏度和應(yīng)用范圍上都不如紫外-可見分光光度計。20世紀(jì)30～60年代，是比色法發(fā)展的旺盛時期，此后就逐漸為分光光度法所代替。

樣本處理：按1ml濃鹽酸：100ml尿加入濃鹽酸保存24h尿。取尿0.5ml加水1.5ml，麝香草酚藍(lán)指示劑一滴，用1mol/L 碳酸氫鈉調(diào)PH 至7.0。加飽和硫酸鈣溶液2ml，搖勻后加入無水乙醇14ml，搖勻，密閉，常溫下放置3 小時以上。2000r/min離心10min，棄上清液，倒入1mol/L 硫酸2ml 中。加入鋅粒，沸水浴30min。蒸發(fā)至剩余液少于0.5ml。用小勺的玻璃棒移鋅粒至管扣，用10g/L 變色酸液0.5ml 沖洗鋅粒，沖洗液全部入管內(nèi)，移出鋅粒。緩慢向試管中加入濃硫酸，混合，沸水浴30ml。冷卻，用1mol/L 硫酸補至10ml，混合，離心取上清液，570nm 波長比色，回收率在89%-98%之間。