分子生物學的發(fā)展促進了基因相關技術在精準醫(yī)療中的應用，即將基因和基于基因修飾的細胞治療放在了醫(yī)療技術發(fā)展變革的最前沿，特別是對于目前尚不能滿足的醫(yī)療需求，這種新型治療技術的的潛力和重要性可與單克隆抗體相比。

但面對日益增加的市場需求，生物公司所面臨的挑戰(zhàn)也與日俱增，特別是基于病毒載體的治療策略。

基因和基于基因修飾的細胞治療方法是將治療性DNA注入患者細胞，以達到治療疾病的目的，包括體內和體外途徑，其可用于替換或糾正錯誤的基因，或編碼一個治療性蛋白。新DNA的導入可使用針對靶細胞的治療性轉基因轉導，即通過直接或基于細胞的基因治療形式。

靶細胞遞送指將“包裝”后的載體導入原本“非許可”的細胞，其方法應可在一定程度上增強治療效力，降低副作用。將基因治療產(chǎn)品遞送至目標位點，需選擇合適的載體?；谳d體的遞送方法可大體分類為病毒或非病毒兩類，理想的載體需具有一下特性：

· 嚴格控制的表達

· 低負作用

· 持續(xù)且可控的治療性作用

· 靶細胞特異性

· 負載容量

一些基因治療方法使用質粒DNA（pDNA）作為非病毒基因遞送載體，其具有良好的安全特性、低毒性以及較大的基因負載，是病毒介導方法的有效補充，并兼容一系列的物理和機械遞送策略。但易受一些“生理性屏障”的限制，如腎清除、溶酶體攻擊以及血清內切酶的降解。

多種機械和物理方法可用于將治療性基因遞送至其靶點，包括微注射、粒子轟擊、激光輻照、電穿孔、聲孔作用以及磁轉染等，各種方法都可在一定程度上將核酸遞送至靶細胞，且可避免病毒載體免疫原性相關的并發(fā)癥，但又各自存在其局限性，特別是對細胞膜和細胞內環(huán)境的影響，此外，也缺乏對關鍵質量特性的控制。

如通常稱為基因槍法的的粒子轟擊技術，其使用重金屬顆粒將特定的裸DNA質粒導入靶細胞，該過程有賴于多種參數(shù)的優(yōu)化，包括顆粒的DNA載入、最終分布、遞送時間以及其它復雜因素，綜合優(yōu)化挑戰(zhàn)較大。而激光輻照方法指在特定光源條件下，靶細胞受影響的位點滲透性將增強，周圍環(huán)境中的基因穿過膜進入細胞；電穿孔和聲孔作用分別指將細胞置于電場或超聲條件下，以在細胞膜上形成特定的“孔道”，使基因進入，這幾種方法都存在一定的“隨機性”，較難進行標準化控制，也易影響細胞原本的特性。

所以，目前約70%的基因治療臨床實驗都采用基于病毒載體的系統(tǒng)。

病毒作為基因遞送載體的優(yōu)點是量大，且已良好定性，特別適用于基因信息的轉化，所以其已成為臨床研究的焦點。病毒的天然生命周期可分為兩個不同的階段：感染和復制。前者指病毒基因組被宿主細胞攝入以及隨后的基因表達。用于基因治療時，需用含修飾基因組的治療性基因盒替換病毒基因組，然后導入靶細胞。

為保證治療的有效性，進入細胞的治療性基因材料數(shù)量需精確控制，以與相應疾病所呈現(xiàn)的特性相符。此外，遺傳性疾病的治療可能需要長期的基因表達，而不是短期或瞬時的。為達到此作用，仔細選擇病毒載體是必要的前提。

腺相關病毒（AAV）和慢病毒在基因治療領域都有不少的適應癥正在研發(fā)當中。

直接基因治療或基于細胞的基因治療方法的第一步，都是將治療性轉基因包裝進遞送載體，然后通過擴增宿主細胞系，以達到足夠高的載體濃度。在直接基因的遞送中，治療性轉基因直接注入體內目標組織；基于細胞的基因治療要求分離并體外培養(yǎng)靶細胞，然后再對其進行基因性修飾，經(jīng)擴增并富集后，重新輸入患者體內。

多種不同類型的病毒可用于此目的，即將基因的功能性拷貝導入患者細胞。基于非病原性AAV的人細小病毒載體非常適合直接基因治療。AAV載體的特點是低免疫原性，即在直接體內應用中相對安全。荷蘭UniQure的阿利潑金是歐洲第一個商業(yè)化的基因治療產(chǎn)品，其即為攜帶人脂蛋白脂肪酶（LPL）基因的AAV1載體，可通過肌肉注射用于家族性脂蛋白脂肪酶缺乏癥（LPLD）。

病毒載體可感染用于細胞治療的分裂或非分裂細胞，其可基因性修飾靶細胞，包括T細胞或成熟細胞，以誘導相應的免疫功能或多能性。此應用過程取決于兩個關鍵點：確定合適的治療性基因，并在維持其有效屬性前提下，將其成功遞送至目標位點。

確定合適的治療性基因并維持其最適轉基因表達條件仍是基因治療中較大的挑戰(zhàn)，因為需要精確的轉基因調節(jié)，以緩解不良效應。有兩個關鍵基因元件可用于調節(jié)轉基因表達：啟動子和增強子。

啟動子通常被分類為基本型或誘導型的，功能可以是通用的或特定于某些組織的，其可啟動特定基因的“基本性”連續(xù)或“誘導性”瞬時轉錄。一般啟動子具有穩(wěn)定的轉錄活性和高度的特異性，如黑素細胞特異性酪氨酸酶啟動子，但也有啟動子效率較低，需要一定程度的“增強”以支持其作用。

增強過程可通過多種方法來達到，包括去除“死亡”的無功能啟動子區(qū)域、復制具有正向調節(jié)元件的位點、組合不同組織特異性啟動子以及使用重組轉錄激活因子，以促進DNA結合或反式激活等過程。當確定合適的治療性基因后，其必需被有效遞送至靶細胞。

病毒載體的生產(chǎn)通?？刹捎脙煞N培養(yǎng)方式：橫向擴展——基于“2D”平面技術的貼壁細胞；縱向擴展——攪拌罐生物反應器內的“3D”懸浮細胞培養(yǎng)。

對于大規(guī)模生產(chǎn)來說，傳統(tǒng)用于實驗室目的的貼壁細胞系統(tǒng)在規(guī)模放大中會面臨很多困難。盡管滿足臨床應用所需的病毒載體實際數(shù)量會有差別，但絕大部分項目都在從小規(guī)模操作向大規(guī)模設備轉移，而進行工藝放大時，必需仔細考慮病毒的敏感性和穩(wěn)定性問題。因為在產(chǎn)量遞增過程中，剪切力、pH條件以及溫度等因素都會愈發(fā)重要。

慢病毒載體出現(xiàn)于90年代，作為γ-逆轉錄病毒載體的安全替代，慢病毒載體快速成為基因和基因修飾細胞治療的重要工具，因其可將基因插入到分裂和非分裂細胞。這類載體被用于生產(chǎn)誘導多能干細胞（iPSC）和直接基因治療或免疫治療激活劑，成為再生醫(yī)學中的奠基性技術。

由于傳統(tǒng)實驗室培養(yǎng)方法的限制以及對慢病毒載體需求的增加，新的更大規(guī)模生產(chǎn)方法正逐步被使用，在常規(guī)的貼壁培養(yǎng)方式中，載體滴度已可達1.7x10^8-2.6x10^8vg/mL（每毫升病毒基因組）。但一般認為，培養(yǎng)于大規(guī)模攪拌式生物反應器的懸浮馴化細胞系更適合治療性產(chǎn)品的表達，因其更易規(guī)模放大，且不再需要使用額外的消化解離試劑。

腺病毒載體可使用人胚腎（HEK293）和人胚視網(wǎng)膜（PER.C6）細胞系生產(chǎn)。在日益增加的臨床需求驅動下，腺病毒載體生產(chǎn)技術的優(yōu)化可有效幫助企業(yè)增加總生產(chǎn)量，提高效率。培養(yǎng)方式方面，貼壁細胞可使用固定床生物反應器、平面式細胞工廠或基于微載體的培養(yǎng)技術。

但在工業(yè)上，更傾向于使用已懸浮馴化的細胞，其可成功生長于無血清培養(yǎng)基，提高安全性，同時降低成本。此外，無血清懸浮培養(yǎng)操作更加直接，也更適于工藝規(guī)模放大至攪拌罐生物反應器，以進行百升至千升級規(guī)模的生產(chǎn)。

對于AAV的生產(chǎn)，瞬時轉染的可獲得產(chǎn)量范圍為10^15-10^16vg，一般即為有效的基因治療范圍。但當前的專利轉染技術已可超過這一數(shù)值，從而滿足更寬泛的臨床適應癥或更高的劑量要求。如用于阿利潑金生產(chǎn)的桿狀病毒表達載體系統(tǒng)（BEVS），其感染sf9細胞，在>100L的生物反應器中，產(chǎn)量可達到10^14-10^16vg/mL。相似的效果還見于用于5型腺病毒（Ad5）和簡單皰疹病毒1（HSV-1）的HeLa和BHK-21細胞。

在下游工藝方面，特別是病毒純化，有一系列的方法可用于分離目的產(chǎn)物，并去除不需要的雜質。但所有方法都必須針對不同類型病毒載體的生理特性和表面特征進行綜合考慮，但行業(yè)的總體趨勢是從傳統(tǒng)的技術，如超速離心，向更易操作和放大的超濾和層析技術轉移。

由于幾乎所有的產(chǎn)品都旨在人體的治療性使用，質量控制（QC）和出廠檢測對于確保產(chǎn)品安全、純度和效力是必需的，但病毒載體的結構復雜性使得這方面的工作非常困難。

理想的檢測可用于提高生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和質量，包括工藝導向的多個方面，如降低操作人員處理錯誤的可能性、刪減開放式手動操作步驟、無縫的工藝流銜接、降低產(chǎn)品污染的幾率等。工藝控制結合多步工藝的簡化可降低變異性，有利于QC和出廠測試的進行，從而獲得符合CGMP要求的產(chǎn)品。