肺癌的發(fā)病率和死亡率已位居各類腫瘤首位，患者的5年相對生存率僅為15%。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是肺癌患者死亡的主要原因。目前認(rèn)為，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。大量的研究結(jié)果顯示，CTCs可以作為一個獨立的指標(biāo)預(yù)測腫瘤的疾病進(jìn)展和患者的生存。CTCs在小細(xì)胞肺癌中的檢出率高達(dá)86%。但是絕大部分肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCLC)，即使在晚期NSCLC患者外周血中，CTCs的檢出率也僅為50%左右。其原因可能為目前的研究中普遍使用上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)分離和鑒定CTCs。由于腫瘤細(xì)胞在侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial－mesenchymal transition，EMT)而丟失細(xì)胞表面的EpCAM表達(dá)，僅基于EpCAM鑒定CTCs將明顯低估CTCs的數(shù)量并可能導(dǎo)致錯誤的臨床假設(shè)和結(jié)論。CTCs的檢測應(yīng)當(dāng)還包括不表達(dá)EpCAM的CTCs。本研究中，我們檢測了不同分期NSCLC患者外周血中的CTCs，基于EpCAM對其進(jìn)行分類并動態(tài)監(jiān)測了治療過程中各類CTCs的數(shù)量變化及其與療效之間的關(guān)系，為進(jìn)一步拓展CTCs在NSCLC中的臨床應(yīng)用提供信息。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

研究對象為南京市胸科醫(yī)院和南京市腫瘤醫(yī)院2012年12月至2013年11月間住院的47例肺癌患者。在患者知情同意的前提下，收集外周血樣品各7.5 ml。47例肺癌患者中，男29例，女18例；年齡44～90歲，平均年齡62歲。TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ期10例，Ⅳ期23例。肺腺癌37例，肺鱗癌10例。3例患者在每一治療周期結(jié)束時采集外周血樣品，根據(jù)世界衛(wèi)生組織實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)，分為完全緩解、部分緩解、疾病穩(wěn)定和疾病進(jìn)展，其中完全緩解和部分緩解為有效，疾病穩(wěn)定和疾病進(jìn)展為無效。

人CD45 Depletion試劑盒、人藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)分選試劑盒購自加拿大Stemcell公司，PE標(biāo)記的鼠抗人CD53單克隆抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的鼠抗人細(xì)胞角蛋白7/8(CK7/8)單克隆抗體、FITC標(biāo)記的鼠抗IgG2a、κ單克隆抗體同型對照及FACS AriaⅢ流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)標(biāo)記的鼠抗人EpCAM單克隆抗體、APC標(biāo)記的單克隆鼠抗IgG2b、κ同型對照購自美國Biolegend公司。

使用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)－K2真空抗凝管通過靜脈穿刺采集外周血樣品7.5 ml。為了避免靜脈穿刺導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞的污染，前2 ml血液予以廢棄。血液樣品采集后4 h內(nèi)分離CTCs，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

血液樣品使用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，用含10%胎牛血清和1 mmol/L EDTA的PBS緩沖液重懸成1×108/ml的細(xì)胞懸液，使用人CD45 Depletion試劑盒，按照說明書去除白細(xì)胞后，細(xì)胞重懸至100 μl，加入5 μl PE標(biāo)記的鼠抗人CD53單克隆抗體，進(jìn)行免疫熒光染色，然后使用PE陽性篩選試劑盒，按照試劑盒說明書再一次去除白細(xì)胞，最終富集出CTCs。

按照文獻(xiàn)中介紹的方法進(jìn)行外周血CTCs的檢測。即將富集后的CTCs重懸至200 μl后分成兩等份(分別對應(yīng)3.75 ml血)，1份加入10 μl APC標(biāo)記的鼠抗人EpCAM單克隆抗體，另外1份加入同樣量和濃度的APC標(biāo)記的鼠抗IgG2b、κ單克隆抗體同型對照。4℃孵育10 min后，PBS洗滌并離心，去除上清液，加入1 ml含1%甲醛的PBS緩沖液，固定細(xì)胞，4℃孵育10 min。PBS洗滌后，加入1 ml Hanks平衡鹽溶液(含0.1%皂苷和0.05% NaN3)4℃通透細(xì)胞5 min，離心去除上清，重懸至100 μl。分別加入10 μl FITC標(biāo)記的鼠抗人CK7/8單克隆抗體及同樣量和濃度的鼠抗IgG2a、κ單克隆抗體同型對照，4℃孵育30 min。PBS洗滌，重懸至300 μl后，經(jīng)FACS AriaⅢ流式細(xì)胞儀鑒定CTCs并計數(shù)。

以FlowJo 7.2.5軟件分析流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果。CTCs的定義為CK 7/8陽性并且不表達(dá)白細(xì)胞表面抗原的細(xì)胞，包括表達(dá)EpCAM的CTCs和不表達(dá)EpCAM的CTCs。由于健康志愿者和良性疾病的患者血液中也可能存在CTCs，設(shè)定上述兩類CTCs的閾值均為1個，以盡可能排除假陽性帶來的誤差。兩類CTCs中只要有一類CTCs的數(shù)量>閾值，則規(guī)定該血液樣品檢出CTCs。為了便于統(tǒng)計學(xué)描述兩類CTCs的數(shù)量以及比較兩者之間的差異，如果同一份血液樣品中兩類CTCs的數(shù)量均≤閾值，則不納入統(tǒng)計分析；如果同一份血液樣品中僅有一類CTCs數(shù)量>閾值時，則另一類<閾值的CTCs的數(shù)量記為0，納入統(tǒng)計分析。

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)(M)和四分位數(shù)間距(QR)進(jìn)行描述。采用Mann－Whitney法和Kruskal－Wallis法比較CTCs的數(shù)量分布，率的比較采用χ2檢驗和Fisher精確檢驗。檢驗水準(zhǔn)為α＝0.05。

47例患者的血液樣品中，總CTCs的檢出率為93.6%(44/47)，其中Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者的總CTCs檢出率分別為85.7%(12/14)、90.0%(9/10)和100%(23/23)。Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者的總CTCs數(shù)量分布見表1。

47例患者的血液樣品中，表達(dá)EpCAM的CTCs檢出率為48.9%(23/47)，其中Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者的檢出率分別為64.3%(9/14)、40.0%(4/10)和43.5%(10/23)。不表達(dá)EpCAM的CTCs檢出率為87.2%(41/47)，其中Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者的檢出率分別為78.6%(11/14)、90.0%(9/10)和91.3%(21/23)。兩類CTCs的總檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，其中Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ期患者的兩類CTCs的檢出率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，而Ⅳ期患者的兩類CTCs檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＝0.001)。

44例檢出CTCs的患者中，表達(dá)EpCAM的CTCs和不表達(dá)EpCAM的CTCs在不同分期患者中的數(shù)量分布見表1。Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者中不表達(dá)EpCAM的CTCs數(shù)量均明顯高于表達(dá)EpCAM的CTCs數(shù)量(均P<0.05)。

在44例檢出CTCs的Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者中，不表達(dá)EpCAM的CTCs數(shù)量占總CTCs的比例<50%的患者分別有1例(8.3%)、0例(0%)和5例(21.7%)；不表達(dá)EpCAM的CTCs數(shù)量占總CTCs的比例在50%～90%的患者分別有8例(66.7%)、3例(33.3%)和2例(8.7%)；不表達(dá)EpCAM的CTCs數(shù)量占總CTCs的比例>90%的患者分別有3例(25.0%)、6例(66.7%)和16例(69.6%)。Ⅳ期患者中，不表達(dá)EpCAM的CTCs數(shù)量>90%的患者比例明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P＝0.030)；而不表達(dá)EpCAM的CTCs數(shù)量在50%～90%的患者比例明顯低于Ⅰ～Ⅱ期患者(P＝0.001)。

例1患者在治療初期病情處于疾病進(jìn)展期，進(jìn)行培美曲塞聯(lián)合卡鉑治療2個周期，疾病穩(wěn)定后發(fā)生進(jìn)展，在隨后的厄洛替尼靶向治療中，疾病進(jìn)一步進(jìn)展并且于1個月后死亡。例2患者在初期疾病進(jìn)展時進(jìn)行培美曲塞聯(lián)合順鉑化療4個周期，疾病穩(wěn)定后部分緩解，最終完全緩解。例3患者在初期顯示疾病進(jìn)展，隨后進(jìn)行了4個周期的厄洛替尼治療，療效分別為疾病穩(wěn)定、疾病穩(wěn)定、疾病進(jìn)展和疾病穩(wěn)定。3例患者的治療療效、病灶大小以及CTCs數(shù)量見表2。14個療效監(jiān)測點中，不表達(dá)EpCAM的CTCs占總CTCs的比例>50%的監(jiān)測點有11個，對應(yīng)的患者療效均為無效(100%)；不表達(dá)EpCAM的CTCs占總CTCs的比例≤50%的檢測點有3個，對應(yīng)的患者療效僅有1例為無效(33.3%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＝0.033)。表明不表達(dá)EpCAM的CTCs數(shù)量占總CTCs的比例>50%時，患者的治療普遍無效。

CTCs在外周血中的數(shù)量極少，檢測前需要首先分離和富集CTCs。由于缺乏特異性的標(biāo)志物，目前的研究主要基于腫瘤細(xì)胞表面EpCAM的表達(dá)來分離CTCs，并對其進(jìn)行計數(shù)。然而這一方法可能明顯低估了CTCs的數(shù)量。本研究中，我們基于以前建立的陰性富集法分離CTCs，結(jié)果顯示，表達(dá)EpCAM的CTCs在Ⅳ期NSCLC患者中的檢出率為43.5%，這與Cell Search儀器檢測的結(jié)果一致。此外，CK 7/8陽性CTCs的檢出率及數(shù)量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于表達(dá)EpCAM的CTCs檢出率，這一結(jié)果與Krebs等報道的結(jié)果一致，但高于黃同海等報道的結(jié)果。表明在NSCLC患者中，采用不依賴EpCAM的方法對CTCs進(jìn)行分離和鑒定更可取。

分期是影響NSCLC患者預(yù)后的重要因素，但CTCs在NSCLC中的臨床診斷價值還沒有明確的結(jié)論。Krebs等的研究結(jié)果顯示，表達(dá)EpCAM的CTCs數(shù)量與NSCLC患者的分期有關(guān)。但Wendel等的研究結(jié)果卻顯示無關(guān)，與本研究結(jié)果一致。這種矛盾的臨床結(jié)論表明，僅僅基于EpCAM對CTCs簡單計數(shù)用于NSCLC的臨床診斷是有局限性的，因為NSCLC患者的外周血中存在一類不表達(dá)EpCAM的CTCs，這類CTCs亞群在目前的臨床研究中被排除在外。目前的研究顯示，CTCs在腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中扮演著關(guān)鍵性的角色。本研究結(jié)果顯示，Ⅳ期患者外周血中不表達(dá)EpCAM的CTCs檢出率明顯高于表達(dá)EpCAM的CTCs檢出率，然而這一差別在Ⅰ～Ⅲ期患者中并未出現(xiàn)，提示不表達(dá)EpCAM的CTCs可能影響NSCLC的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此我們在本研究中采用CTCs數(shù)量的相對值來反映CTCs的分布。結(jié)果顯示，Ⅳ期患者中，不表達(dá)EpCAM的CTCs>90%患者的比例明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，這表明不表達(dá)EpCAM的CTCs數(shù)量在NSCLC患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移后占有絕對優(yōu)勢。因此，不表達(dá)EpCAM的CTCs>90%可能是一個有價值的指標(biāo)，用于評估NSCLC患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。同時還發(fā)現(xiàn)，Ⅳ期患者中，不表達(dá)EpCAM的CTCs在50%～90%患者的比例明顯低于Ⅰ～Ⅱ期。有研究顯示，EMT是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機制，并且腫瘤細(xì)胞表面的EpCAM表達(dá)在EMT過程中將會下調(diào)或丟失。因此，不表達(dá)EpCAM的CTCs應(yīng)當(dāng)包括了發(fā)生EMT的CTCs。上述結(jié)果可能預(yù)示了發(fā)生EMT的CTCs在NSCLC早期入血以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移后數(shù)量增加。因此，需要對CTCs進(jìn)行EMT特征鑒定，這將可能進(jìn)一步闡明肺癌的轉(zhuǎn)移機制，并可能發(fā)現(xiàn)一類新的標(biāo)志物用于肺癌的臨床診斷。

為了進(jìn)一步探討CTCs及其表型的變化所具有的臨床診斷價值，我們對3例患者治療過程中兩種CTCs的數(shù)量和相對比例變化進(jìn)行了動態(tài)監(jiān)測。結(jié)果顯示，表達(dá)與不表達(dá)EpCAM的CTCs數(shù)量僅僅在治療有效時呈現(xiàn)出遞降趨勢，而在治療無效時呈現(xiàn)出無序變化。這表明CTCs的簡單計數(shù)用于NSCLC患者的療效評估是有局限性的。有研究顯示，發(fā)生EMT的CTCs所占的比例與乳腺癌患者的化療療效有關(guān)，比例越高，療效越差。3例患者中，14個監(jiān)測點的結(jié)果顯示，不表達(dá)EpCAM的CTCs占多數(shù)時，患者的治療療效普遍不佳。此外，初期治療有效但不表達(dá)EpCAM的CTCs占多數(shù)時，患者進(jìn)一步的治療也會變得無效。這表明不表達(dá)EpCAM的CTCs可能在療效上起著更為重要的作用。因為不表達(dá)EpCAM的CTCs數(shù)量越多，發(fā)生EMT的肺癌細(xì)胞數(shù)可能也越多，而EMT的發(fā)生能夠增強腫瘤細(xì)胞的耐藥性。需要強調(diào)的是，不表達(dá)EpCAM的CTCs中也可能存在內(nèi)皮細(xì)胞或非腫瘤細(xì)胞等。因此，應(yīng)進(jìn)一步探究不表達(dá)EpCAM的CTCs的生物學(xué)功能及其與療效之間的關(guān)系，從而為優(yōu)化肺癌的治療方案提供理論基礎(chǔ)。