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上次我們對微生物群落多樣性的測序是否需要重復(fù)的問題進(jìn)行了討論，并從統(tǒng)計學(xué)、生物學(xué)以及實際操作上說明了生物學(xué)重復(fù)的必要性。那到底需要多少個重復(fù)才是合理呢？3個？5個？還是10個？今天我們來仔細(xì)探討一下這個問題。

那每組一個重復(fù)不能開展差異檢驗分析的話，每組3個重復(fù)是否就可以了？從統(tǒng)計學(xué)來說，3個重復(fù)確實可以。例如一般的t檢驗，每組至少3個重復(fù)就能算均值方差，從而進(jìn)行t檢驗。

但t檢驗本身是一種有監(jiān)督檢驗方法，需要依賴數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，而在多次隨機抽樣中，微生物的豐度分布并不一定符合正態(tài)分布，因此有時候需要開展無監(jiān)督檢驗方法。Wilcoxon秩和檢驗就是一種常用的方法。但我們通過其檢驗臨界表可以發(fā)現(xiàn)，在0.01的水平下至少需要5個重復(fù)才能找到數(shù)據(jù)，也就是才能開展分析。

因此，總結(jié)來說，要開展有效的差異檢驗分析，必須要有至少3個，甚至5個樣本重復(fù)才可以。

舉個例子，如果需要開發(fā)一種藥物針對性治療某種疾病，而這種疾病經(jīng)過研究是與腸道微生物有關(guān)，那很自然想到通過分析尋找腸道群落的biomarker?，F(xiàn)在有兩個實驗室同時對正常與疾病人群采樣進(jìn)行研究，其中A實驗室每組采集3個樣本作為重復(fù)，而B實驗室每組采集50個樣本。兩個實驗室都通過差異檢驗分析得到一些候選物種作為biomarker，你是藥物研發(fā)公司的投資人，會選誰的結(jié)果作為依據(jù)來開發(fā)藥物？

很顯然，在進(jìn)行容錯率越低的研究時候（例如藥物研發(fā)，疾病機理等），我們需要更多的樣本重復(fù)來消除背景誤差，以精確的找到目標(biāo)，因此B實驗室的結(jié)果在這種環(huán)境下更讓人“放心”。

同時，樣本的復(fù)雜程度越高，理論需因此推薦，要的重復(fù)數(shù)也越多。一般的水體研究，可以開展5個以上重復(fù)，土壤、植物10個以上，而人體腸道微生物研究，則推薦20個以上樣本。

由于實驗條件的差異，經(jīng)常造成測序所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量差別很大。例如同一批數(shù)據(jù)，同一組中某重復(fù)a、b的tag數(shù)目都是20萬，另外一個重復(fù)c則是3萬。我們可以采用抽平分析策略來解決數(shù)據(jù)量差異問題，但著會造成a、b數(shù)據(jù)的極大浪費。如果直接用原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，后期分析肯定會造成極大誤差。其實由于c數(shù)據(jù)出現(xiàn)極端異常，很有可能是離群樣本，因此合理的方法是把c樣本剔除。但由于開始只有3個重復(fù)，在剔除樣本后沒辦法開展后續(xù)差異分析。

為了解決這數(shù)據(jù)剔除的問題，最簡單有效的方法就是在實驗設(shè)計時候增加樣本數(shù)，如果設(shè)計的是10個樣本，那么后期就算剔除3個（已經(jīng)非常多了），也還可以開展后續(xù)分析。當(dāng)然，考慮到成本情況下，一般還是推薦至少5個重復(fù)。