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雖然人體能夠產(chǎn)生千千萬萬種抗體，但在我們利用抗體進(jìn)行疾病的診斷、治療及預(yù)防時(shí)，更多情況下需要特異性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)均一、可重復(fù)大量生產(chǎn)的高純度抗體。單克隆抗體的出現(xiàn)，解決的抗體制備過程中的特異性和可重復(fù)性問題，得到了廣泛的應(yīng)用。 這里介紹單克隆抗體的制備及幾種常見的基因工程抗體。
一、單克隆抗體的制備 自單克隆抗體制備技術(shù)問世以來，其制備程序基本類似[1]： 首先用提純過的免疫原對(duì)健康小鼠進(jìn)行免疫。免疫劑量、途徑與間隔時(shí)間的選擇，均以獲得高效價(jià)抗體為最終目的。在一定劑量范圍內(nèi)，免疫原劑量越大，產(chǎn)生的抗體效價(jià)越高。一般被免疫動(dòng)物的血清抗體效價(jià)越高，融合后細(xì)胞產(chǎn)生高效價(jià)特異抗體的可能性越大，而且單克隆抗體的質(zhì)量（如濃度、親和力等）也與免疫過程中小鼠血清抗體的效價(jià)和親和力密切相關(guān)。末次免疫后3～4天，分離小鼠脾細(xì)胞（B細(xì)胞）以進(jìn)行融合。 與小鼠細(xì)胞進(jìn)行融合的理想的骨髓瘤細(xì)胞株需滿足以下要求：1.細(xì)胞株穩(wěn)定，易于傳代培養(yǎng)；2.細(xì)胞株自身不會(huì)產(chǎn)生抗體或細(xì)胞因子；3.該細(xì)胞是次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)換酶（hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase，HGPRT）的缺陷株。此外，需與免疫小鼠同源。 融合細(xì)胞應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞形態(tài)、活性佳。在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，因而在培養(yǎng)融合細(xì)胞或細(xì)胞克隆化培養(yǎng)時(shí)，還需加入其他飼養(yǎng)細(xì)胞。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠的腹腔細(xì)胞，亦有用小鼠的脾細(xì)胞、大鼠或豚鼠的腹腔細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的。 細(xì)胞融合是產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的中心環(huán)節(jié)。目前，通常選擇PEG用于促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞融合，其原理可能是PEG導(dǎo)致細(xì)胞膜脂類物質(zhì)物理結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜容易打開，有助于細(xì)胞融合。融合反應(yīng)后，用培養(yǎng)液稀釋，消除PEG的作用。 融合后的細(xì)胞進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)添加次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、甲氨蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）。骨髓瘤細(xì)胞合成DNA通常有兩條途徑，一是利用糖和氨基酸合成核苷酸進(jìn)而合成DNA，甲氨蝶呤可阻斷該途徑；當(dāng)甲氨蝶呤存在時(shí)，細(xì)胞通過HGPRT和TK（胸腺嘧啶核苷激酶）利用核苷酸的前提合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA。因此，在HAT培養(yǎng)液中，未能雜交的骨髓瘤細(xì)胞由于DNA合成途徑分別被甲氨蝶呤和HGPRT代謝缺陷所阻斷，導(dǎo)致不能合成完整的DNA，不能增殖而死亡。未能雜交的脾細(xì)胞（指B細(xì)胞）在一般培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)繁殖，5～7天內(nèi)死亡。所以，HAT培養(yǎng)一周左右，僅成功融合的雜交瘤細(xì)胞能夠存活，達(dá)到選擇培養(yǎng)的目的。對(duì)HAT選擇培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行稀釋，選擇高抗體分泌的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存待用。 大量制備單克隆抗體的方法有動(dòng)物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。在動(dòng)物體內(nèi)誘生法中，通常選擇小鼠作為產(chǎn)抗動(dòng)物，小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，誘生出腹腔腫瘤并產(chǎn)生含單克隆的腹腔積液。在體外培養(yǎng)發(fā)中，可將雜交瘤細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，或進(jìn)行高密度培養(yǎng)，如利用發(fā)酵罐或細(xì)胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)，產(chǎn)量可明顯增加。 單克隆抗體可按所要求的純度不同采用相應(yīng)的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達(dá)到純化目的，也有采用較簡(jiǎn)單的酸沉淀方法。目前最有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法。 二、基因工程單克隆抗體 最初制備成功的單克隆抗體為鼠源性抗體，盡管鼠源抗體親和力強(qiáng)，但在治療和檢測(cè)方面都存在一定的缺陷。 鼠源單抗與NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面Fc段受體親和力弱，產(chǎn)生的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）較弱，而且它與補(bǔ)體成分結(jié)合能力低，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力較弱。此外鼠單克隆抗體還具有免疫原性，易引起宿主人抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng)[2,3]。這樣一方面降低了單抗的效價(jià)，另一方面又會(huì)給病人帶來不良反應(yīng)，因此鼠源性單克隆抗體在運(yùn)用臨床治療前還需改善。同樣由于HAMA反應(yīng)，在疾病診斷過程總中使用鼠源抗體會(huì)導(dǎo)致部分樣本出現(xiàn)假陽性結(jié)果。 因此，在鼠源抗體的基礎(chǔ)上，人們對(duì)其編碼DNA進(jìn)行重組，使抗體部分或全部由人類基因所編碼，降低其免疫原性，制備了人-鼠嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
（B） 非人源、人-鼠嵌合、人源化及全人源抗體的Fab片段來源 人-鼠嵌合抗體：是用人源基因代替鼠源單抗的恒定區(qū)。這樣，不僅保留了抗原抗體結(jié)合的特異性，又能夠大大降低鼠源單抗的免疫原性。其制備原理是，將功能性抗體輕、重鏈可變區(qū)基因分別與人抗體的κ鏈和重鏈CH1恒定區(qū)基因進(jìn)行重組，克隆到表達(dá)載體中，構(gòu)建成鼠－人嵌合的Fab 基因表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞表達(dá)。第一個(gè)用于腫瘤治療的基因工程抗體藥物美羅華（Rituximab）就是由鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)組成的嵌合抗體。但由于嵌合抗體可變區(qū)（V）仍占整個(gè)抗體分子的30%，鼠源性部分的框架區(qū)（FR）依舊有一定的免疫原性，仍可能誘發(fā)HAMA反應(yīng)。 人源化抗體：對(duì)人-鼠嵌合抗體進(jìn)一步進(jìn)行人源化，主要手段是重構(gòu)抗體和表面重塑技術(shù)[4]。重構(gòu)抗體即互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）的移植，將鼠抗體的CDR移植到人抗體的相應(yīng)部位，可使抗體人源化程度達(dá)到90%以上，是目前人源化單抗較常用的方法。表面重塑技術(shù)是將鼠源抗體FR部分表面氨基酸殘基進(jìn)行人源化改造，以人抗體表面相似氨基酸替換鼠源FR部分與人抗體中差別明顯的部分，這種方法能夠在最大程度上維持抗體選擇性親和力的同時(shí)減少異源性。 全人源抗體：雖然人源化抗體極大的解決了鼠源性抗體的免疫原性問題，但生產(chǎn)過程中仍有一定的困難。人源化過程需要大量繁復(fù)的計(jì)算機(jī)模擬，并進(jìn)行不同的氨基酸取代以保持抗體的選擇性親和力，工作量巨大。并且，人源化抗體依舊含有少量鼠源性成分，仍可能引起HAMA反應(yīng)等。相比之下，所有序列都來源于人的全人源抗體安全性更好，被認(rèn)為是用于治療的理想抗體。目前主要通過3種途徑來研制：噬菌體抗體庫、核糖體展示技術(shù)及轉(zhuǎn)基因小鼠制備人源性抗體。 三、小分子抗體及其特性 在單克隆抗體及其人源化的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步降低免疫原性、降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量、優(yōu)化抗體穩(wěn)定性等，研發(fā)了各種小分子基因工程抗體。主要包括Fab片段、單鏈抗體及單域抗體。 Fab片段：抗體的可變區(qū)，是抗體識(shí)別與結(jié)合抗原的片段，完整的抗體分子經(jīng)酶消化后，可生成Fab與Fc兩種不同片段，如圖3。用于酶切抗體的酶主要包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和無花果蛋白酶[6]。其中木瓜蛋白酶消化IgG抗體是用于獲得Fab最傳統(tǒng)的方法。 Fab分子無需糖基化，可使用原核系統(tǒng)如大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)。因大腸桿菌周質(zhì)能提供氧化環(huán)境及形成二硫鍵所需的硫醇-二硫鍵氧化還原酶，由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)Fab片段均具有完整的立體折疊和鏈內(nèi)、鏈間二硫鍵，保留抗體識(shí)別與結(jié)合抗原的能力[5]。Fab片段抗體無Fc片段，極大的降低了其免疫原性，但也因此作為藥物在人體內(nèi)降解迅速，半衰期短。為延長(zhǎng)Fab半衰期，可將Fab片段與蛋白結(jié)合或?qū)⑵銹EG化。 單鏈抗體（single chain Fv，ScFv）：由抗體重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL通過一段連接肽（linker）連接形成的一條單一的多肽鏈，是親代抗體全部抗原結(jié)合特異性的最小功能結(jié)構(gòu)單位。與Fab相同，ScFv沒有恒定區(qū)片段，不需要進(jìn)行糖基化，因此可在原核系統(tǒng)中表達(dá)，最常用的表達(dá)受體為大腸桿菌[8]。ScFv的主要優(yōu)點(diǎn)包括：易于構(gòu)建和表達(dá)、分子質(zhì)量小、穿透力強(qiáng)、特異性好、免疫原性低。但同時(shí)，ScFv也有一些缺點(diǎn)，主要包括親和力較低，較其親本單克隆抗體，親和力低10-1000倍；穩(wěn)定性較差，尤其在37℃時(shí)，常有聚集傾向；半衰期短[9]。
單域抗體(single domain antibodys, sdAb)：是基于單一結(jié)構(gòu)域的識(shí)別單元，這種抗體的親和性較低，還需進(jìn)行優(yōu)化。用基因工程方法獲得的sdAb主要有三類： 第一類是從駱駝科動(dòng)物天然缺失輕鏈的重鏈抗體（HCAb）獲得的重鏈可變區(qū)，即單一的折疊單元，保留了完整的抗原結(jié)合活性，是最小的天然抗體片段[10]。HCAb中的這種由重鏈可變區(qū)結(jié)合抗原的單一結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的抗體稱為單域重鏈抗體（variable domain of the heavy-chain of heavy-chain antibody，VHH）。 第二類是從鯊魚等軟骨魚中發(fā)現(xiàn)的無輕鏈或其他蛋白分子伴隨的類似于HCAb的新的或護(hù)士鯊抗原受體（IgNAR）獲得的重鏈可變區(qū)。 第三類是從人源或鼠源單克隆抗體獲得的重鏈或輕鏈的可變區(qū)，它們雖保留額抗原結(jié)合特異性，但因親和性和可溶性大為下降，實(shí)際應(yīng)用較罕見。 由于駱駝科動(dòng)物比軟骨魚類更容易飼養(yǎng)和免疫，因而更常被研究人員使用。sdAb比scFv結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單，易與受體結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)，在研發(fā)疫苗、治療藥物、診斷試劑和生物技術(shù)研究工具等方面均有較大的發(fā)展空間。 四、單克隆抗體的命名 與其他大多數(shù)藥物不同，單克隆抗體的命名基于其來源和靶物質(zhì)采用了不同的詞干。 世界衛(wèi)生組織的國(guó)際通用藥物名稱（INN）對(duì)各詞干進(jìn)行了定義。見表1. 表1.單克隆抗體詞干含義表（FromWikipedia）
參考文獻(xiàn)
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