10×擴(kuò)增緩沖液 　   10 ul

4種dNTP混合物 　 各200 umol/L

引物 　　　　 　     各10～100 pmol

模板DNA 　　　 　0.1～2 ug

Taq DNA聚合酶 　  2.5 u

Mg²⁺　　　　　　 1.5 mmol/L

加雙或三蒸水至 　  100 ul

二、PCR引物設(shè)計(jì)

PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。

1.   引物設(shè)計(jì)的基本原則

（1）  引物長度：15-30 bp，常用為20 bp左右。

（2） 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

（3） 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。

（4）兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。

（5） 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。

（6）引物3‘端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，最佳選擇是G和C。

（7） 引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

2.   引物設(shè)計(jì)軟件

Primer Premier5.0 （自動(dòng)搜索）*、Oligo6 （引物評價(jià)）、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 （在線服務(wù)）。

三、模板的制備

（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

（2）模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。

（3）標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。

四、PCR反應(yīng)條件的控制

1.  PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。 

2.  鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。

　　
3.  底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。

　
4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。

　　
5.  引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。

　
6.  反應(yīng)溫度

（1）變性溫度和時(shí)間95℃，30 s。

（2）退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。

（3）延伸溫度和時(shí)間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）。

（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)

7.  循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。

五、PCR的循環(huán)參數(shù)
 
1.  預(yù)變性（Initial denaturation）

模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。

2.  循環(huán)中的變性步驟

循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間，變性時(shí)間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。

3.  引物退火（Primer annealing）

退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。

退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

4.  引物延伸

引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略

延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp。

5.  循環(huán)數(shù)

大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

6.  最后延伸

在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。

六、PCR步驟
 
1.  DNA變性

（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

2.  退火

（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.  延伸

（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

七、PCR檢測
 
PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜喗菀仔?，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。

1.  由于PCR反應(yīng)靈敏度很高，因此要特別主意防止DNA污染的發(fā)生。樣品間的相互污染可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，特別是將PCR技術(shù)應(yīng)用到臨床病原菌感染確定中。

1.  假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

（1）模板原因

①  模板中含有雜蛋白質(zhì)。

②  模板中含有Taq酶抑制劑。

③  模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白。

④  在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。

⑤  模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

（2）酶失活

①  需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。

②  忘加Taq酶或溴乙錠。

（3）引物

①  引物質(zhì)量。

②  引物的濃度。

③  兩條引物的濃度是否對稱。

解決對策：

①  選定一個(gè)好的引物合成單 位。

②  引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。

③  引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。

④  引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

（4）Mg²⁺濃度

①  濃度過高降低PCR擴(kuò)增的特異性。

②  濃度過低影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

（5）反應(yīng)體積的改變

①  通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定;

②  在做小體積如20 ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。

（6）物理原因
 
①  變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性。

②  退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。

③  擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度有問題。

（7）靶序列變異

①  靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合。

②  靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列。