在高通量測(cè)序的生物信息分析服務(wù)中，基本提供的都是一套流程化的服務(wù)。雖然我們天天說(shuō)個(gè)性化服務(wù)，但是真正能提出個(gè)性化服務(wù)的人寥寥無(wú)幾。多數(shù)人停留在能看懂圖表的程度上（這個(gè)程度其實(shí)真心不錯(cuò)了呢），但是對(duì)于其背后的意義了解的不夠多，所以才無(wú)法提出真正適合自己的個(gè)性化分析要求。從今天開始，小編就講講生信分析內(nèi)容后面的原理，水平有限，小伙伴們湊合看，有磚輕拍，可以扔雞蛋。這樣小編就有飯吃了，笑。飯是一口一口吃滴，路是一步一步走滴，今天先說(shuō)說(shuō)最基礎(chǔ)的生物功能富集分析。

在表達(dá)分析中，包括芯片表達(dá)譜和RNA-seq，我們能得到海量的數(shù)據(jù)。將其表達(dá)量進(jìn)行歸一處理后（以前小編有講過(guò)表達(dá)量計(jì)算這個(gè)問題），基于一個(gè)cutoff值，我們能收獲成堆的差異基因。此處關(guān)鍵的步驟在于獲得的成百上千的差異基因要怎么處理？我們就可以基于生物功能富集分析，將其歸納到生物學(xué)通路上，以此為基礎(chǔ)，揭示和理解生物學(xué)過(guò)程的基本分子機(jī)制，為后續(xù)研究指明方向。

生物功能富集到現(xiàn)在，經(jīng)歷多年的發(fā)展，也在不斷的進(jìn)步。

第一代過(guò)代表分析方法（ORA），這類方法以 Fisher's exact test 為代表。它的輸入數(shù)據(jù)是一個(gè)由差異基因構(gòu)成的列表，這些基因之間相互平等，沒有權(quán)重。即其針對(duì)的數(shù)據(jù)是一組感興趣的基因(基因列表)，其目的是在這組基因中發(fā)現(xiàn)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)上富集的基因功能集。

第二代功能集打分方法（FCS），這類方法以 GSEA 為代表。它不僅要輸入基因列表，而且需要賦予每個(gè)基因一個(gè)感興趣的統(tǒng)計(jì)量。一般是t統(tǒng)計(jì)量或者Fold Change之類。

第三代基于通路拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析方法（PT），以 SPIA 為代表。它的輸入需要在第一代或第二代方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)際的生物信號(hào)通路的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，就是需要提供例如，C基因在A和B基因上游，激活A(yù)，且抑制B，這類信息。存在的主要問題，一個(gè)是已知的生物數(shù)據(jù)不完整，再一個(gè)是模型復(fù)雜，抗干擾能力差。輸入的一點(diǎn)兒擾動(dòng)可能就是完全不一樣的結(jié)果。對(duì)了，最常用的GO等注釋數(shù)據(jù)庫(kù)中基因功能集中不包含任何拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)信息，僅提供了可能屬于同一通路的所有基因列表。因而，PT 方法不能被用于GO通路的富集分析。

現(xiàn)在還有基于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的NT方法。利用數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因相互作用關(guān)系來(lái)間接地把基因的生物學(xué)屬性整合入功能的富集分析。這些方法的主要思路是利用現(xiàn)有的全基因組范圍的生物網(wǎng)絡(luò)。此類富集方法出現(xiàn)時(shí)間較短，目前還不是主流，不多介紹啦。小伙伴們持續(xù)關(guān)注即可。

今天主要介紹第一代和第二代方法。

第一代ORA方法是目前最為廣泛的方法，目前常見的KEGG富集分析，GO富集分析等等本質(zhì)上都是此類方法。此類方法基于經(jīng)典統(tǒng)計(jì)學(xué)的檢驗(yàn)方法。其基本步驟包括先將給定的基因列表與待測(cè)功能集做交集，找出其中共同的基因并進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后利用統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的方式來(lái)評(píng)估觀察的計(jì)數(shù)值是否顯著高于隨機(jī)，即待測(cè)功能集在基因列表中是否顯著富集. 常見的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法有卡方檢驗(yàn)，F(xiàn)isher 精確檢驗(yàn)和二項(xiàng)分布檢驗(yàn)。最為廣泛使用的是 Fisher精確檢驗(yàn)，根據(jù)超幾何分布來(lái)檢驗(yàn)基因列表中的基因在待測(cè)功能集中是否顯著富集。

在一個(gè)RNA-seq中，得到了20000個(gè)mRNA，計(jì)算表達(dá)量。然后，根據(jù)一個(gè)cutoff值來(lái)確定差異表達(dá)基因。一般我們會(huì)用Fold Change≥2且p≤0.05這樣的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)篩選，我們得到了200個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因。同時(shí)，我們?cè)跀?shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)20000個(gè)表達(dá)基因有300個(gè)基因?qū)儆贏通路，200個(gè)差異上調(diào)表達(dá)基因里其中有10個(gè)屬于A通路。我們可以得到如下一個(gè)表格。將除掉總和之后的四個(gè)數(shù)字輸入到軟件中，既可以得到P值。有大批的在線軟件可以實(shí)現(xiàn)。同學(xué)們感興趣的可以試試。

這時(shí)候我們可以看看A通路是不是在上調(diào)差異基因中具有顯著性，如果是，我們可以認(rèn)為在此實(shí)驗(yàn)條件下A通路上調(diào)表達(dá)。ORA方法基于完備的統(tǒng)計(jì)學(xué)理論,具有結(jié)果穩(wěn)健、可靠。但也有一定的局限性：在對(duì)基因進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí), 丟失了基因的表達(dá)水平或表達(dá)差異值等基因?qū)傩孕畔?；把通路中的所有基因進(jìn)行同等對(duì)待，忽視了基因在通路內(nèi)部生物學(xué)意義的不同及基因間復(fù)雜的相互作用；在獲得感興趣的基因時(shí)，往往需要選取合適的閾值。

FCS 的檢驗(yàn)對(duì)象則是待測(cè)基因功能集中的所有基因。FCS 方法的基本步驟包括：首先對(duì)基因組中所有基因表達(dá)水平的差異值進(jìn)行打分或排序；其次把待測(cè)基因功能集中的每個(gè)基因的分?jǐn)?shù)通過(guò)特定的統(tǒng)計(jì)模型轉(zhuǎn)換為待測(cè)基因功能集的分?jǐn)?shù)或統(tǒng)計(jì)值。最后利用隨機(jī)抽樣獲得的待測(cè)基因功能集統(tǒng)計(jì)值的背景分布來(lái)檢驗(yàn)實(shí)際觀測(cè)的統(tǒng)計(jì)值的顯著水平，并判斷待測(cè)基因功能集在案例和對(duì)照實(shí)驗(yàn)狀態(tài)下是否發(fā)生了統(tǒng)計(jì)上的顯著變化。額，說(shuō)了一大段感覺和沒說(shuō)的區(qū)別不大。

介紹下常用的一個(gè)工具GSEA。其基本思路是首先基于表達(dá)差異值對(duì)全基因組基因進(jìn)行排序得到基因列表，然后檢驗(yàn)待測(cè)基因功能集中的基因相對(duì)于隨機(jī)情況而言，是否顯著地位于基因列表的頂端或底端，即待測(cè)基因集的表達(dá)水平在案例和對(duì)照實(shí)驗(yàn)狀態(tài)下是否發(fā)生了明顯的變化。本質(zhì)是一個(gè)變種的Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)。在此插個(gè)題外話，Kolmogorov是一位極其出名的科學(xué)家，曾有人懷疑過(guò)其不是一個(gè)人，而是一個(gè)研究所……

GSEA的界面長(zhǎng)這樣，嗯，比較丑，所以才沒有流行開來(lái)?？茨莻€(gè)色條，這代表了你所得到的mRNA。還是以上面那個(gè)例子為例。此時(shí)這個(gè)色條就是那20000個(gè)mRNA，從紅色到藍(lán)色，表示從上調(diào)到下調(diào)。黑色豎線表示在該位置處的基因?qū)儆贏通路，一共300個(gè)。色條下方有條虛線，我們能看到，在此位置，色條由紅轉(zhuǎn)藍(lán)，它表示這這里基因表達(dá)從上調(diào)轉(zhuǎn)變成下調(diào)。在GSEA這個(gè)檢驗(yàn)里面，我們實(shí)際上就是在檢驗(yàn)?zāi)男┖谏Q線是否有往顏色條一端富集的趨勢(shì)。當(dāng)然，這個(gè)圖顯示的和咱們的數(shù)據(jù)例子是反著的，小伙伴們可以扔雞蛋了。

在FCS方法中，不同方法采用了不同的統(tǒng)計(jì)模型來(lái)計(jì)算待測(cè)基因功能集的統(tǒng)計(jì)值。如 GSEA使用了加權(quán)的近似KS檢驗(yàn)，GSA利用基因的表達(dá)差異的t值的絕對(duì)值來(lái)計(jì)算待測(cè)基因功能集的統(tǒng)計(jì)值，PADOG采用基因的t值加權(quán)平均值，Global Test則采用了經(jīng)驗(yàn)貝葉斯廣義線性模型等等。總體而言, FCS 相較于ORA方法在理論上有明顯突破，考慮到了基因表達(dá)值的屬性信息，而且以待測(cè)基因功能集為對(duì)象來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)，也使得檢驗(yàn)結(jié)果更加靈敏. 但FCS方法仍然把待測(cè)基因功能集中的每個(gè)基因作為獨(dú)立的個(gè)體，忽略了基因的生物學(xué)屬性和基因間的復(fù)雜相互作用關(guān)系。

今天主要介紹RNA-seq分析中基礎(chǔ)且關(guān)鍵的生物功能富集。希望大家能夠有所啟發(fā)，理解這些檢驗(yàn)方法背后的思想，從而在做自己的數(shù)據(jù)分析時(shí)能夠真正的提出自己的問題，有能力定制適合自己的分析方法。

文案：崔鵬鵬

編輯：王   倩