上一期的RNA-seq結(jié)果解讀，我們和生信小白們談了一下差異基因分析中的火山圖、韋恩圖、聚類(lèi)圖（點(diǎn)這里查看這一期微信）。

本期咱們看看RNA-seq如何利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)！

GO（gene ontology）數(shù)據(jù)庫(kù)，收集的是對(duì)各種物種基因功能進(jìn)行限定和描述的標(biāo)準(zhǔn)詞匯（term），是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能描述分類(lèi)系統(tǒng)。根據(jù)基因產(chǎn)物的相關(guān)生物學(xué)過(guò)程（ biological_process）、細(xì)胞組分（cellular_component）以及分子功能（molecular_function）三個(gè)大類(lèi)分別給予定義，而每一大類(lèi)下又包含更多層級(jí)具體term，這些定義與具體物種無(wú)關(guān)。

KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是一個(gè)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，整合了基因組信息、化學(xué)信息和生化系統(tǒng)功能信息，目前包含了16個(gè)子數(shù)據(jù)庫(kù)。比如，KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫(kù)包含了圖解的細(xì)胞代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳導(dǎo)等通路信息； KEGG GENES數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG GENOME數(shù)據(jù)庫(kù)則包含了部分或者完整序列的基因/基因組信息；KEGG Orthology（KO）是KEGG直系同源數(shù)據(jù)庫(kù)，將各個(gè)KEGG注釋系統(tǒng)聯(lián)系在一起，將分子網(wǎng)絡(luò)和基因組信息聯(lián)系起來(lái)，根據(jù)直系同源關(guān)系，實(shí)現(xiàn)跨物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組的功能注釋。

圖示解析：

1. 橫坐標(biāo)：GO三個(gè)基本分類(lèi)（BiologicalProcess、CellularComponent、Molecular Function）以及各類(lèi)的下一層級(jí)term，從中可以看到描述BP、CC或MF的具體term有哪些。通過(guò)該圖對(duì)應(yīng)的表格可以查找某一基因的具體功能信息。

2. 縱坐標(biāo)：注釋到某一term（該term及其子term）的基因數(shù)目。

圖示解析：

1. 有向無(wú)環(huán)圖（DAG圖）：GO數(shù)據(jù)庫(kù)中，3大獨(dú)立的ontology（BP、CC、MF）下面又可以獨(dú)立出不同的亞層次，層層向下構(gòu)成一個(gè)ontologies的樹(shù)型分支結(jié)構(gòu)，即有向無(wú)環(huán)圖型。

2. RNA-seq中，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，采用topGO軟件包實(shí)現(xiàn)有向無(wú)環(huán)圖，展示差異基因富集的GO term及其層級(jí)關(guān)系，從上至下所定義的功能范圍越來(lái)越具體。

3. 對(duì)BP、CC、MF三大類(lèi)各取富集程度最高的前10位作為DAG圖主節(jié)點(diǎn)（方框表示），通過(guò)包含關(guān)系（is_a和part_of）將相關(guān)聯(lián)的GO term一起展示，顏色越深代表富集程度越高，可以看出某一個(gè)term可以有多個(gè)箭頭指向。比如 biological process term 'hexose biosynthesis' 有兩個(gè)parents：'hexose metabolism'和'monosaccharide biosynthesis'，這是因?yàn)樯锖铣墒谴x的一種，而己糖又是單糖的一種。

4. 每一個(gè)節(jié)點(diǎn)（方框or橢圓），包含4行信息：GO term的id、該term的描述、GO富集的Corrected P-Value、該term下差異基因的數(shù)目/該term下基因組背景基因的數(shù)目。

圖示解析：

1. RNA-seq中，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，可以通過(guò)散點(diǎn)圖展示。此圖中，KEGG富集程度通過(guò)Rich factor、qvalue和富集到此通路上的基因個(gè)數(shù)來(lái)衡量。

2. 橫坐標(biāo)是Rich factor，數(shù)值越大表示富集程度越大。Rich factor=位于該pathway term下的差異表達(dá)基因數(shù)/位于該pathway term下的所有有注釋基因數(shù)。

3. 縱坐標(biāo)是富集程度較高的pathway term（一般選取富集最顯著的20條進(jìn)行展示，不足20條則全部列出）。

4. q value是經(jīng)過(guò)多重校驗(yàn)的p value，取值范圍[0，1]，以顏色表示，越紅表示q value越小，說(shuō)明富集越明顯。

5. 點(diǎn)的大小表示該term下差異基因的個(gè)數(shù)，點(diǎn)越大表示基因數(shù)越多。

圖示解析：

1. RNA-seq中，KEGG通路圖是將差異表達(dá)基因所處的通路信息進(jìn)行展示。

2. 對(duì)于有參考基因組的物種，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的差異基因構(gòu)建KEGG通路圖時(shí)可以選擇物種特異性通路圖（Organism-specificpathway map），物種相關(guān)的通路節(jié)點(diǎn)以綠色背景的方框表示。

3. 節(jié)點(diǎn)（矩形框）代表某一基因、該基因編碼的酶及這個(gè)酶參與的反應(yīng)?？蛑械臄?shù)字是EC編號(hào)。網(wǎng)頁(yè)版通路圖分析結(jié)果中，點(diǎn)擊該節(jié)點(diǎn)可以獲得具體的信息（如下圖）。550369是KEGG中的基因ID， T01004是物種標(biāo)識(shí)符，然后是基因的名稱(chēng)，屬于哪個(gè)KO分類(lèi)以及表達(dá)的酶，對(duì)應(yīng)的物種信息，參與哪些代謝途徑，下面還有結(jié)構(gòu)、序列信息等等。

   
   
   

4. 紅色邊框表示該差異基因是上調(diào)的，綠色邊框表示下調(diào)。上圖展示的是有參轉(zhuǎn)錄組差異基因參與的類(lèi)固醇生物合成途徑。有時(shí)還會(huì)遇到黃色邊框標(biāo)注的，表示既有上調(diào)的也有下調(diào)的。粉色邊框表示該節(jié)點(diǎn)是有差異的，但不區(qū)分具體上、下調(diào)。

5. 對(duì)于沒(méi)有基因組序列的物種，選擇無(wú)參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，此時(shí)構(gòu)建KEGG通路圖選擇的是 KO Reference pathway，不區(qū)分具體物種信息，節(jié)點(diǎn)以藍(lán)色背景標(biāo)注（如下圖）。

KEGG通路圖中各種符號(hào)的含義：

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文案：杜德超（轉(zhuǎn)錄調(diào)控事業(yè)部）

編輯：賈紅麗