摘要：篩選真菌細胞壁抑制劑的過程中得到一株鏈霉菌H6794。為確定其抗真菌活性成分，以粗糙脈胞霉原生質(zhì)體為模型，采用活性追蹤的方法分離。

真菌病害是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要原因之一，每年植物因病害造成的減產(chǎn)達15%?；瘜W農(nóng)藥對植物病害的防治扮演了重要的角色，但隨著人們對化學農(nóng)藥的毒性及殘留問題的日益重視，開發(fā)高效低毒的生物農(nóng)藥已成為亟待解決的問題。由于哺乳動物細胞中沒有細胞壁，真菌細胞壁抑制劑對人體的影響相對較小。

在篩選真菌細胞壁抑制劑的過程中得到一株鏈霉菌H6794。為確定其抗真菌活性成分，以粗糙脈胞霉原生質(zhì)體為模型，采用活性追蹤的方法分離到H6794-A。本文報道該活性產(chǎn)物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及活性研究。

一、菌株分離與培養(yǎng)

（1）產(chǎn)生菌 從中國西藏自治區(qū)曲積縣的土壤中分離獲得，編號H6794。

（2）培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基:ISP3;種子培養(yǎng)基（%）:可溶性淀粉2.5，葡萄糖1，酵母粉0.5，黃豆粉0.5，CaCO3 0.2;發(fā)酵培養(yǎng)基（%）:燕麥2，葡萄糖1，糊精2.5，蛋白胨1，酵母粉0.5，KH2 PO4 0.05，CaCO 3 0.2，pH7.0。從28℃培養(yǎng)7d的ISP3斜面上取適量菌體，接種于種子培養(yǎng)基中，28℃220r/min培養(yǎng)2d;將該種子培養(yǎng)液按10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃220r/min培養(yǎng)6d。

二、活性測試

采用改良的Selitrennikoff方法，結(jié)合倒置顯微鏡觀察原生質(zhì)體的再生情況。

三、活性產(chǎn)物的分離純化

發(fā)酵液經(jīng)大孔吸附樹脂柱，正丁醇萃取，菌絲用丙酮浸提后濃縮，正丁醇萃取。合并正丁醇萃取液，濃縮，硅膠柱層析分離，得到黃褐色粉末。進一步以制備液相色譜分離。制備柱:Hypersil C18 （10.0mm×150mm，5μm），流動相:45%乙腈∶水（0.015%甲酸）;流速5ml/min;檢測波長210nm。收集H6794-A組分，蒸干得純品。

四、 結(jié)構(gòu)鑒定

（1）譜學方法

儀器 EPI QSTAR質(zhì)譜儀;NICOLET200SXV FT-IR紅外光譜儀;Bruker Avance600核磁共振儀。5mg H6794-A溶于0.5ml DMSO中，由Varian Unity INOVA-400儀記錄氫信號;重水交換溶劑為CD 3 COCD 3 和D 2 O;50mg H6794-A溶于0.5ml DMSO中，記錄 13 C-NMR、DEPT、HMQC和HMBC圖譜。

（2）化學方法

酸水解 稱取一定量H6794-A，加入6mol/L HCl，酒精噴燈封口，110℃烘箱中水解2h。采用改良的Merfey方法 ［4］ 將酸水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成FDLA衍生物，并通過LC/MS（Agilent1100）鑒定構(gòu)成H6794-A的氨基酸組成。

堿水解 由于環(huán)狀化合物在質(zhì)譜儀中不容易打出碎片，因而對H6794-A進行開環(huán)處理。5mg H6794-A溶于5ml0.035mol/L NaOH，37℃水解12h，HCl中和至pH7.0。正丁醇萃取水解液，將萃取液蒸干，質(zhì)譜測定堿水解得到的開環(huán)化合物。

五、 抗植物致病真菌活性

供試菌 小麥赤霉病菌（Fusarium graminea-rum）、黃瓜枯萎病菌［Fusarium oxgsporum（Sch1）f.sp cucumerium Owen］、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers）均分離自患病植株。

對植物致病真菌室內(nèi)抑制活性測定 將H6794-A粉劑加水配成50、100、200和400倍稀釋藥液，對照藥劑配成100和200倍稀釋液，用時分別稀釋10倍。制取含藥培養(yǎng)基（9ml PDA+1ml藥液），凝固后用打孔器切取正常培養(yǎng)基上的供試植物病原菌菌絲體移入其中，置25～26℃溫箱中培養(yǎng)。6d后量取菌落直徑，并根據(jù)菌落擴展直徑的長度與對照組比較，求出抑制百分率。對照藥劑分別為70%甲基托布津WP、50%速克靈WP、50%多菌靈超微WP。