在發(fā)酵工業(yè)中，對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌廣泛使用濕熱滅菌法。工廠里，蒸汽比較容易獲得，控制操作條件方便，是一種簡(jiǎn)單而又價(jià)廉、有效的滅菌方法。

    用濕熱滅菌的方法處理培養(yǎng)基，其加熱受熱時(shí)間與滅菌程度和營(yíng)養(yǎng)成分的破壞都有關(guān)系。營(yíng)養(yǎng)成分的減少將影響菌種的培養(yǎng)和產(chǎn)物的生成，所以滅菌程度和營(yíng)養(yǎng)成分的破壞成為滅菌工作中的主要矛盾，恰當(dāng)掌握加熱受熱時(shí)間是滅菌工作的關(guān)鍵。

一、濕熱滅菌相關(guān)理論：

1、微生物的死亡速率：對(duì)數(shù)殘留定律

微生物受熱死亡的原因，主要是因高溫使微生物體內(nèi)的一些重要蛋白質(zhì)，如酶等發(fā)生凝固、變性，從而導(dǎo)致微生物無法生存而死亡。微生物受熱而喪失活力，但其物理性質(zhì)不變。在一定溫度下，微生物的受熱死亡遵照分子反應(yīng)速度理論。在滅菌過程中，微生物的死亡速率與任一瞬時(shí)殘存的活菌數(shù)成正比，即對(duì)數(shù)殘留定律。

用N表示殘留活菌個(gè)數(shù)，則活菌的減少率（死亡率）與N呈線性關(guān)系，即：

積分邊界條件：N₀→N_θ；t₀=0

注：

式中，θ：滅菌時(shí)間（s）；

K，滅菌速度常數(shù)；

N₀：滅菌開始時(shí)培養(yǎng)基中雜菌個(gè)數(shù)（個(gè)）；

N：經(jīng)過滅菌時(shí)間θ后殘存的活菌數(shù)（個(gè)），一般取N = 0.001，即1000次滅菌中有1 次失敗

關(guān)于上述公式幾點(diǎn)說明：

（1）K值越大，微生物越易死亡；

（2）一定溫度下，K隨M種類不同而異。一般來說，細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體、酵母菌、放線菌、病毒及噬菌體對(duì)熱的抵抗力較弱，而細(xì)菌芽孢、霉菌孢子則較強(qiáng)。

（3）隨著溫度的變化，K有很大變化。溫度對(duì)K的影響遵循阿侖尼烏斯定律：

A：系數(shù)，s-1；

△E：活化能，J/mol；

R：氣體常數(shù)，8.314 J/(mol·K)；

T：絕對(duì)溫度。

2、兩種常見滅菌方式：分批滅菌和連續(xù)滅菌理論時(shí)間計(jì)算及優(yōu)劣比較

（1）分批滅菌

分批滅菌通常分為升溫、保壓和降溫三個(gè)階段。

如只考慮保溫階段，以耐熱的芽孢桿菌為滅菌對(duì)象，發(fā)酵罐內(nèi)裝培養(yǎng)基40m³，121℃分批滅菌，初始培養(yǎng)基中含芽孢10⁷個(gè)/mL，關(guān)于理論滅菌時(shí)間T計(jì)算可根據(jù)公式：       

其中A=1.34×10³⁶ s^-1，

ΔE=2.844×10⁵ J/mol，

則k=0.0281 s^－1；

No=40×10⁶×10⁷=4×10¹⁴個(gè)，

Nt=0.001個(gè)，則T=24min，

理論上與一般分批滅菌條件121℃滅菌30min相差不大；若考慮升溫階段對(duì)滅菌的貢獻(xiàn)，初始溫度從100℃計(jì)算，從保溫開始時(shí)培養(yǎng)基中活微生物數(shù)不是No而是Np，則：

其中Km為100℃至121℃時(shí)間內(nèi)滅菌常數(shù)平均值：

 k_m＝0.0061s^－1，Np＝2.65×10¹¹個(gè)，保溫滅菌時(shí)間T=19.7min?？紤]升溫段的滅菌作用后，保溫時(shí)間比不考慮的減少了18％。因此，發(fā)酵罐體積越大，其分批滅菌的升溫時(shí)間長(zhǎng)，就更應(yīng)考慮升溫段的滅菌作用，其保溫時(shí)間應(yīng)更短。

（2）連續(xù)滅菌

連續(xù)滅菌過程中，培養(yǎng)基需要在短時(shí)間被加熱到滅菌溫度（130-140℃），短時(shí)間保溫（5-8min），快速冷卻，進(jìn)入已滅菌完畢的發(fā)酵罐。如忽略升溫的滅菌作用，根據(jù)公式

得到停留時(shí)間T=2.7min。從上述數(shù)據(jù)得出連續(xù)滅菌時(shí)間短，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損耗相對(duì)較少，然而連續(xù)滅菌對(duì)設(shè)備要求較高。

二、影響培養(yǎng)基滅菌效果的主要因素

1、培養(yǎng)基成分

培養(yǎng)基中的油脂、糖類和蛋白質(zhì)通常能夠增加微生物的耐熱性，使微生物的熱致死速率變慢，這主要是因?yàn)橛袡C(jī)物質(zhì)會(huì)在微生物細(xì)胞外形成一層薄膜，阻礙熱的傳入，因此應(yīng)提高滅菌溫度或延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。相反培養(yǎng)基中高濃度的鹽類（如8%以上NaCl溶液）、色素會(huì)減弱微生物細(xì)胞的耐熱性，一般較易滅菌。在固形物含量高的情況下，滅菌溫度要高些。

2、培養(yǎng)基的pH值

pH對(duì)微生物的耐熱性影響很大。在pH6.0-8.0范圍內(nèi)微生物最耐熱，pH<>時(shí)，氫離子極易滲入細(xì)胞內(nèi)，從而改變細(xì)胞的生理反應(yīng)促進(jìn)其死亡，故pH愈低，滅菌所需的時(shí)間愈短。一般微生物生長(zhǎng)對(duì)培養(yǎng)基的pH都有一定的要求，在不允許調(diào)節(jié)pH的情況下，就要考慮適當(dāng)延長(zhǎng)滅菌時(shí)間或提高滅菌溫度。

3、培養(yǎng)基的物理狀態(tài)

培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對(duì)滅菌有極大的影響。固體培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間要比液體培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間長(zhǎng)，如果100℃時(shí)液體培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間為1h，固體培養(yǎng)基則需要2-3h才能達(dá)到同樣的滅菌效果。其原因在于液體培養(yǎng)基滅菌時(shí)，熱量傳遞是由傳導(dǎo)作用和對(duì)流作用完成的，而固體培養(yǎng)基只有傳導(dǎo)作用而沒有對(duì)流作用。此外，液體培養(yǎng)基中水的傳熱系數(shù)要比固體有機(jī)物質(zhì)大得多。越濃稠的培養(yǎng)基滅菌所需時(shí)間越長(zhǎng)。

4、泡沫

泡沫中的空氣會(huì)形成隔熱層，使傳熱困難，對(duì)滅菌極為不利。對(duì)易產(chǎn)生泡沫的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時(shí)，可加入少量消泡劑。

5、培養(yǎng)基中的微生物性質(zhì)與數(shù)量

不同成分的培養(yǎng)基中含菌性質(zhì)與量是不同的。培養(yǎng)基中微生物數(shù)量越多，達(dá)到無菌要求所需的滅菌時(shí)間也越長(zhǎng)。天然基質(zhì)培養(yǎng)基，特別是營(yíng)養(yǎng)豐富或變質(zhì)的原料中的含菌量遠(yuǎn)比化工原料的含菌量多，因此滅菌時(shí)間要適當(dāng)延長(zhǎng)。含芽孢桿菌和霉菌孢子多的培養(yǎng)基，要適當(dāng)提高滅菌溫度或延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。

6、冷空氣排除情況

高壓蒸汽滅菌的關(guān)鍵問題是為熱的傳導(dǎo)提供良好條件，而其中最重要的是使冷空氣從滅菌器中順利排出。因?yàn)?/span>冷空氣導(dǎo)熱性差，阻礙蒸汽接觸欲滅菌物品。降低蒸汽分壓使之不能達(dá)到應(yīng)有的溫度，如果滅菌器內(nèi)冷空氣排除不徹底，壓力表所顯示的壓力就不單是罐內(nèi)蒸汽的壓力，還有空氣的分壓，罐內(nèi)的實(shí)際溫度低于壓力表所對(duì)應(yīng)的溫度，造成滅菌溫度不夠，檢驗(yàn)滅菌器內(nèi)空氣排除度，可采用多種方法，最好的辦法是發(fā)酵罐同時(shí)裝有壓力表和溫度計(jì)。

三、全自動(dòng)發(fā)酵滅菌技術(shù)

自動(dòng)滅菌介紹：

    滅菌在發(fā)酵過程中是一道必不可少的工序，決定著后續(xù)細(xì)菌培養(yǎng)的成敗，當(dāng)然，滅菌過程也會(huì)對(duì)培養(yǎng)基有一定的損傷和破壞作用。一段高質(zhì)量的滅菌過程，既能夠確保滅菌效果（除菌率99.999999%），又能夠確保培養(yǎng)基的新鮮度。目前國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)發(fā)酵設(shè)備采用人工操作，三路進(jìn)汽的方式對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行實(shí)罐滅菌，人為影響不確定因素較大。甚至于出現(xiàn)同樣的培養(yǎng)基配方，同樣的發(fā)酵工藝，發(fā)酵收率相差很大。國(guó)外目前大都采用智能控制，自動(dòng)滅菌的方案。能夠確保滅菌過程中的培養(yǎng)基的受熱和損傷程度一致，設(shè)備多冷點(diǎn)監(jiān)測(cè)，可以確保滅菌過程無死角。還可以降低了人工勞動(dòng)力，減少了人為不確定因素導(dǎo)致滅菌失敗的風(fēng)險(xiǎn)。

自動(dòng)滅菌控制界面由豐澤生物提供

自動(dòng)滅菌特點(diǎn)：

全自動(dòng)原位在線滅菌整個(gè)過程采用PLC全自動(dòng)線性控制，其特點(diǎn)如下：

1 溫度控制：罐內(nèi)溫度控制精度及靈敏度高，多階段溫度控制可保證升溫、恒溫及降溫分段控制及強(qiáng)大的延時(shí)功能，

2 壓力控制：高保真的壓力模擬曲線控制確保了罐頭殺菌過程的補(bǔ)壓、反壓及特殊產(chǎn)品殺菌的壓力控制。

3 操作流暢：發(fā)酵控制系統(tǒng)中可存儲(chǔ)多個(gè)殺菌公式，亦可現(xiàn)場(chǎng)方便地輸入新的殺菌公式，適合于不同產(chǎn)品的滅菌。溫度實(shí)時(shí)在線控制及顯示可使操作工及時(shí)掌握整個(gè)殺菌過程，完美的人機(jī)對(duì)話功能可使操作人員簡(jiǎn)易的完成操作。

4 完美記錄：全自動(dòng)滅菌技術(shù)采用了我們成熟的殺菌溫度記錄系統(tǒng)技術(shù)，控制系統(tǒng)通過RS485通訊和電腦連接，系統(tǒng)可實(shí)時(shí)地顯示整個(gè)殺菌控制過程，亦可將殺菌過程的溫度壓力曲線自動(dòng)地存儲(chǔ)到計(jì)算機(jī)中，用戶可以隨時(shí)查閱。也可以通過打印機(jī)隨時(shí)打印，可實(shí)現(xiàn)工廠遠(yuǎn)程控制和遠(yuǎn)程數(shù)據(jù)管理。

文/風(fēng)卷殘?jiān)?整理 

本作者主要出沒于《發(fā)酵工程》代謝機(jī)理研究群、《發(fā)酵工程》大工藝6群

江蘇豐澤生物工程設(shè)備制造有限公司
創(chuàng)建于2001年5月,注冊(cè)資金11600萬元，占地面積21320平方米。公司專業(yè)從事全自動(dòng)發(fā)酵設(shè)備的設(shè)計(jì)、制造以及自動(dòng)化生物反應(yīng)過程控制軟件的研究、開發(fā)，產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物工程各領(lǐng)域。已有3000臺(tái)套的各類發(fā)酵設(shè)備在全國(guó)的制藥、食品、飼料、肥料、環(huán)保、高校、科研院所等行業(yè)運(yùn)行。
目前市場(chǎng)占有率達(dá) 50% 以上。
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