原創(chuàng)作者：吉賽生物|www.geneseed.com.cn

RNase R ( Ribonuclease R ) 是一種來源于大腸桿菌RNR超家族的3’-5’核糖核酸外切酶，可從3’-5’方向將RNA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R能夠消化幾乎所有的線性RNA分子，但不易消化環(huán)形RNA，因此常用于circRNA的富集和鑒定實驗。湖人今天將介紹RNaseR在circRNA研究中的具體應用和常見問題。

1 RNase R的應用

1.1.circRNA高通量測序

高通量測序是大批量發(fā)現(xiàn)circRNA最快捷的方法，目前對于circRNA的高通量測序主要有兩種策略[1]。第一種將total RNA去除rRNA（核糖體RNA）后直接進行建庫測序，不做RNase R消化（RNase R-），也叫全轉錄組測序。第二種將total RNA去除rRNA后進行RNase R消化（RNase R+），以使circRNA相對富集，再進行建庫測序，這種策略結果中circRNA的junction reads相對于RNase R-樣本有5-10倍的富集，一般能發(fā)現(xiàn)幾千到上萬個circRNAs，差異表達的有幾百到幾千個。

圖1 RNase R+和RNase R- RNA測序示意圖（Jeck WR, Sharpless NE, 2014）

1.2 Northern blot

Northern blot是一項特異性檢測RNA的雜交技術，使用探針可對內源性的circRNA和/或mRNA同時/分別做定量和定性檢測。

對于線性mRNA的探針，按照一般設計方法設計即可。而呈環(huán)形的circRNA需要針對其Splice Junction位置設計探針。

若同時使用mRNA探針和circRNA的Splice Junction探針進行檢測，結果中RNase R-組中應該可以同時檢測到mRNA和circRNA的條帶。而在RNase R+組中只能檢測到circRNA條帶，檢測不到mRNA的條帶（或條帶變淡）[2]。

圖2 Northern blot同時使用circRNA和mRNA探針（Rybak-Wolf, A. et al., 2015）

注：實驗中也可對mRNA和circRNA的同源序列設計探針，用來同時檢測mRNA和circRNA。

1.3 PCR檢測

Total RNA經(jīng)RNase R消化后可于70℃ 10 min使酶滅活后直接進行逆轉錄反應，確保在RNase R-和RNase R+組中使用等量的total RNA，統(tǒng)一以RNase R-組的內參（ACTB或GAPDH）作為計算標準。

圖3 RNase R消化后以qPCR檢測β-actin和FGFR2

圖4 RNase R消化后以qPCR檢測hsa_circ_0006404和has_circ_0007874

文章里常見的一個結果如圖5，分別以Divergent Primer和Convergent Primer檢測cDNA和gDNA樣品。圖中gDNA中Divergent Primer無條帶，Convergent Primer有條帶；RNase R+組中Divergent Primer有條帶，Convergent Primer無條帶；RNase R-組中Divergent Primer和Convergent Primer都有條帶，表明檢測的基因呈環(huán)形，且耐受RNase R消化[3]。

圖5 RNase R消化后分別以Divergent Primer和Convergent Primer檢測cDNA和gDNA樣品（Yibing Y et al., 2018）

2 RNase R消化實驗步驟

2.1 反應體系

推薦按表1配置反應體系。

注：3-4 U/μg RNA為參考文章適用于人或小鼠total RNA的比例，其他物種或條件可能需要適當調整。

2.2 反應條件

37℃10-30 min。

注：1）可隨RNA增加適當延長消化時間，一般10-30 min即可消化掉大部分的線性RNA，PCR檢測線性RNA豐度有幾百倍的降低。消化1 h以上是非必要的，因為時間過長可能導致少數(shù)耐受力弱的circRNA被消化。2）孵育后可先純化回收，或者70℃ 10 min使酶滅活后直接進行下游實驗。

2.3 純化回收

消化后的RNA可使用苯酚：氯仿：異戊醇（25: 24:1, V: V）溶液抽提，再使用乙醇沉淀回收；或者使用RNA純化柱和磁珠進行純化回收。

注：苯酚：氯仿：異戊醇（25: 24:1, V: V）溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，沒有試劑也可以Trizol Reagent代替。

3 常見問題

3.1 內參的選擇

應用于RNase R消化前后或處理與不處理組的對比，PCR檢測的常用內參ACTB或GAPDH都因被消化而不能使用。此時可將原始的RNA樣品等分為兩份，一份經(jīng)RNase R消化（RNase R+），另一份不處理（RNase R-），以RNase R-組的內參作為計算標準。

3.2 定量計算

將原始RNA樣品等分為兩份，一份經(jīng)RNase R消化，另一份不處理，此時認為兩組中RNA等量，內參一致，以不處理組的內參（ACTB或GAPDH）作為計算標準。

考慮RNase R消化后如果進行純化回收，則RNase R+組中RNA濃度/總量可能有變化，不適宜再以RNase R-組的內參（ACTB或GAPDH）作為計算標準。此時可在純化回收前加入少量其他物種的RNA作為外參，統(tǒng)一以外參標準化樣品后進行計算[4]。

Total RNA經(jīng)RNase R消化后直接進行RT-PCR的，一般可以不做純化回收，保持70℃ 10 min使酶滅活后直接進行RT即可。

3.3 Total RNA消化后應該是怎樣的？

對于真核生物的total RNA，RNase R-組中28S/18S/5S三條帶單一明亮（5S較淡），而RNase R+組中28S/18S/5S條帶變淡或不可見。但如果RNase R+組中5S條帶加亮，且28S/18S條帶處有拖尾，則可能是RNA被外源RNA酶降解，而不是RNase R消化產(chǎn)生的。

如圖6中使用10 U RNase R消化2.5 μg total RNA，保持37℃ 30 min，之后直接進行電泳檢測，結果顯示RNase R+組28/18/5S條帶變淡（不可見），表明RNase R對total RNA的消化作用。

圖6 Total RNA 經(jīng)RNase R消化后直接進行電泳檢測

3.4 實驗結果一致性（重復性）差

常見的RNase R消化RNA后進行qPCR檢測等實驗，容易碰到的問題是多次重復實驗的結果差別很大，可能的原因和解決方法如下。

1）加樣不準，RNA或RNase R的用量有誤差，導致內參不齊或者消化程度不一致。在同一對比實驗中，除了是否加RNase R外，應確保其他所有反應條件一致。

2）兩次重復實驗結果不一致。盡量同時進行RNase R+和RNase R-組的消化實驗，使用相同的反應條件，PCR檢測使用同樣的條件和引物等。

3）檢測mRNA和circRNA豐度都沒有明顯變化。可能由于RNase R消化反應體系、程序不對，或者RNA使用量過多。實驗中應使用配套的10X Reaction Buffer配置反應液，使用推薦的反應溫度和時間，另外添加MgCl2（Mg2+濃度最高0.5 mM）可以增強RNase R的活性。

4）RNase R+組檢測不到circRNA。可能由于circRNA豐度過低未能檢測到，或者RNA樣品被外源RNA酶降解。實驗中應使用RNase-Free（DEPC處理）的槍頭、離心管和水等耗材試劑。

5）RNase R+組中circRNA豐度有明顯降低。除了考慮RNA樣品被外源RNA酶降解外，也有發(fā)現(xiàn)少數(shù)circRNA耐受RNase R消化力弱的，提示檢測的circRNA可能也被消化。

吉賽生物RNase R全新上線，即日起至6月30日購買產(chǎn)品立享8折優(yōu)惠，詳情請詢當?shù)劁N售，全國免費服務熱線：400-8989-400。

參考文獻：1. Jeck WR, Sharpless NE. Detecting and characterizing circular RNAs. Nat Biotechnol. 2014; 32:453–61.

2. Rybak-Wolf, A. et al.. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Mol. Cell. 58, 870–885 (2015).

3. Yibing Yang et al.. Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis. J Natl Cancer Inst. 2018 Mar 1;110(3).

4. Pamudurti, Nagarjuna Reddy et al.. Translation ofCircRNAs. Molecular Cell , Volume 66 , Issue 1 , 9 - 21.e7.

特別聲明：本文為網(wǎng)易自媒體平臺“網(wǎng)易號”作者上傳并發(fā)布，僅代表該作者觀點。網(wǎng)易僅提供信息發(fā)布平臺。