摘要外源基因中的稀有密碼子是影響大腸埃希菌(大腸桿菌)表達(dá)的重要因素。稀有密碼子尤其是串聯(lián)稀有密碼子能降低甚至耗竭胞內(nèi)同源tRNA,降低蛋白表達(dá)水平,并具有顯著的位置效應(yīng)。另外,稀有密碼子可以引起外源mRNA翻譯過程中的移碼翻譯、核糖體跳躍和氨基酸錯(cuò)配等異常事件。本文就稀有密碼子影響大腸杄菌蛋白表達(dá)的機(jī)制研究作一糸統(tǒng)綜述。

在所有生物的基因中,對(duì)同義密碼子的使用都不是隨機(jī)的,不同的生物對(duì)同義密碼子的選擇有著不同的偏性。對(duì)大腸桿菌基因密碼子使用頻率分析表明,幾乎所有簡(jiǎn)并密碼子家族都對(duì)其中一個(gè)或兩個(gè)密碼子有偏性,高表達(dá)基因比低表達(dá)基因的密碼子偏性更顯著。同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)同源tRNA的相對(duì)數(shù)量有直接關(guān)聯(lián),通常反映出其同源tRNA的濃度。

很多外源基因尤其是真核基因含有大量大腸桿菌稀有密碼子,這些稀有密碼子的存在是很多外源基因不能在大腸桿菌得到高效表達(dá)的原因之一。目前有關(guān)稀有密碼子的研究主要限于精氨酸稀有密碼子AGA/AGG,究主要限于精氨酸稀有密碼子AGA/AGG,子。本文就有關(guān)稀有密碼子影響大腸桿菌蛋白表達(dá)的機(jī)制研究作一系統(tǒng)綜述。

一、稀有密碼子的解碼速率

核糖體在稀有密碼子位點(diǎn)翻譯速率降低的發(fā)現(xiàn)最早來(lái)自于對(duì)分泌蛋白內(nèi)稱之為暫停位點(diǎn)的研究12。在這些蛋白的跨膜運(yùn)輸過程中,在暫停位點(diǎn)存在不完全多肽中間物,研究發(fā)現(xiàn)暫停位點(diǎn)由幾個(gè)稀有密碼子組成。這是由于稀有密碼子的同源tRNA豐度很低,在核糖體的A位以隨機(jī)方式尋找與稀有密碼子配對(duì)的同源氨酰tRNA需要花費(fèi)比偏性密碼子更長(zhǎng)的時(shí)間,導(dǎo)致多肽延伸的翻譯速率降低。蛋白合成速率由翻譯起始速率(Ri)和核糖體在mRNA的移動(dòng)速率所決定通常偏性密碼子的解碼速率(Ra)與稀有密碼子的解碼速率(Rb)都在大于Ri,因而對(duì)蛋白合成速率并無(wú)影響。只有在某些條件下當(dāng)稀有密碼子的同源tRNA供應(yīng)不上時(shí),Rb就會(huì)大大低于Ri,引起核糖體停在稀有密碼子處,并阻礙了隨后的核糖體蛋白合成mRNA上形成核糖體串,這串核糖體的數(shù)目由Ra和Rb的速率比所決定。

二、串聯(lián)稀有密碼子對(duì)蛋白表達(dá)的抑制

對(duì)AGA/AGG密碼子的研究結(jié)果表串聯(lián)AGA/AGG能顯著降低蛋白表達(dá)水平,分散的AGA/AGG對(duì)蛋白表達(dá)水平影響不大,因而對(duì)蛋白表達(dá)的抑制作用并不完全,依賴于特異基因中某種稀有密碼子的數(shù)量。將(AGG)4和( GCGAGG)6插入氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因同一位點(diǎn),當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄速率不超過一定限度時(shí),兩者表達(dá)水平基本相同。當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄速率超過一定限度時(shí),插入串聯(lián)(AGG)4的CAT基因表達(dá)水平急劇下降,而插入( GCGAGG)5的CAT基因表達(dá)水平則繼續(xù)升高當(dāng)靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄達(dá)到一定水平,串聯(lián)AGG密碼子能夠引起RNAAGA/的占據(jù)效應(yīng),耗竭細(xì)胞內(nèi)游離的RNAA0MAC°,AGG的解碼速率大大降低。當(dāng)核糖體在解碼AGG密碼子時(shí),肽酰tRNAmRNA-核糖體三元復(fù)合物中P位RNAAGA/A的釋放有賴于其下一個(gè)密碼子的迅速解碼,當(dāng)下一個(gè)密碼子也是AGG時(shí)tRNA0MA在P位上被占據(jù)的時(shí)間就會(huì)大大延長(zhǎng)。如果基因轉(zhuǎn)錄速率超過一定限度,過多的mRNA上的串聯(lián)AGG密碼子就會(huì)完全占據(jù)胞內(nèi)稀有的tRNA00,A位的AGG密碼子無(wú)法解碼,P位占據(jù)的tRNA GA/AO不能釋放,導(dǎo)致基因表達(dá)停止。但只要未達(dá)到轉(zhuǎn)錄的限制速率,那么tRNAAGA/A濃度的降低保持在一個(gè)中等水平就不會(huì)限制蛋白表達(dá),這表現(xiàn)為隨著轉(zhuǎn)錄速率的提高出現(xiàn)蛋白表達(dá)的“全或無(wú)”效應(yīng);而分散的AGG密碼子則不會(huì)產(chǎn)生占據(jù)效應(yīng),P位的 trNA隨著下一個(gè)密碼子的迅速解碼能夠很快釋放,因而對(duì)胞內(nèi)的tRNAA0AAc濃度不會(huì)有太大影響。但也有文章與該規(guī)律不一致。如hGM-CSF只有一個(gè)AGG,與編碼tRNA400M的argU基因共表達(dá)后表達(dá)量能提高3~4倍。 Calderone等將一個(gè)含有4個(gè)分散AGA/AGG的156個(gè)氨基酸融合蛋白基因的3個(gè)AGA都突變?yōu)榇竽c桿菌偏性的CGC,表達(dá)量提高了2~3倍￥”。在大腸桿菌中表達(dá)牛胎盤催乳激素時(shí),基因內(nèi)有9個(gè)分散的AGA/AGG密碼子,改變其中5個(gè)AGA/AGG密碼子偏性,使蛋白表達(dá)水平由低于10%提高至30碼子是為了在翻譯起始區(qū)避免二級(jí)結(jié)構(gòu),以獲得更有效的翻譯起始。但這種假說不能解釋一些現(xiàn)象首先是稀有密碼子的位置效應(yīng),有時(shí)一個(gè)單獨(dú)的稀有密碼子就能降低蛋白表達(dá)水平第二,這個(gè)抑制效果不是二級(jí)結(jié)構(gòu)所形成,因?yàn)橹挥性诨蜣D(zhuǎn)錄速率達(dá)到一定水平才會(huì)有顯著抑制作用;另外這種抑制作用能被稀有tRNA的過量表達(dá)所克服。第三,通過在起始巒碼子附近插入連續(xù)重復(fù)序列產(chǎn)生廣泛二級(jí)結(jié)構(gòu),并沒有降低基因的表達(dá)水平2),另外一種假說認(rèn)為基因起始處的稀有密碼子可以導(dǎo)致核糖體暫停,以便更有效地容許新生肽鏈折疊。

AGA/AGG高含量基因表達(dá)引起的tRNAVA/耗竭可以導(dǎo)致細(xì)菌存活力和質(zhì)粒穩(wěn)定性降低,已表明 tRNA GAY與細(xì)菌中DNA復(fù)制相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)?？赡苁沁@些蛋白起始位點(diǎn)附近含有AGA/AGG密碼子,當(dāng) tRNA耗竭后,使這些基因不能得到有效表達(dá),抑制了核酸復(fù)制和細(xì)菌生長(zhǎng)

四、移碼翾譯、核糖體跳躍和氨基酸錯(cuò)配

移碼翻譯是蛋白翻譯過程中幾個(gè)異常事件的綜合結(jié)果,是指核糖體在翻譯過程中改變其閱讀框架,向+1或-1方向移動(dòng)一個(gè)核苷酸,導(dǎo)致一種新的多肽或蛋白質(zhì)的合成。

雖然移碼翻譯的機(jī)制各不相同,但存在些共同之處。首先是翻譯過程中必須發(fā)生核糖體暫停。第2個(gè)共同點(diǎn)是移碼翻譯需要肽酰-tRNA的重新配對(duì),也就是核糖體選擇的同源tRNA能與移碼后的另一個(gè)密碼子配對(duì)或接近配對(duì),稀有密碼子引起的移碼事件可以嚴(yán)重影響外源蛋白表達(dá)的質(zhì)量和數(shù)量。 spanjaard等發(fā)現(xiàn)A-AGG-AGG-U序列能夠產(chǎn)生50%的核糖體十1移碼,A-AGAAGA-U也可以引起高效移碼,將表達(dá)tRNA4AA的基因共表達(dá)或?qū)GA/AGG改為大腸杄菌偏性密碼子都可以抑制移碼翻譯的發(fā)生,表明這個(gè)移碼翻譯是由tRNA0M缺乏引起的AGA/AGG解碼錯(cuò)誤造成的1, vilboils等在大腸桿菌表達(dá)人可溶性兒茶酚-0-甲基轉(zhuǎn)移酶( hCOMT)時(shí)發(fā)現(xiàn)在最后一個(gè)密碼子CCC處產(chǎn)生+1移碼,除 hCOMT外,得到一個(gè)C末端多了11個(gè)氨基酸的蛋白產(chǎn)物, Gursky等報(bào)道將AGG-AGG插入CAT基因終止密碼子TGA之前,可引起-1移碼,蛋白表達(dá)量提高了3~10倍,CAT基因的mRNA量也相應(yīng)地增長(zhǎng),表明其基因3′端的移碼翻譯對(duì)mRNA降解具有保護(hù)作用19)。

稀有密碼子導(dǎo)致的核糖體暫停還可以引起核糖體跳躍或氨基酸錯(cuò)配。在大腸桿菌表達(dá)牛胎盤催乳激素時(shí),85~87位的密碼子TTG-AGG-TTG處能發(fā)生核糖體跳躍事件。86位AGG引起肱酰tRNA在85位TTG暫停,肽酰tRNA能越過AGG與87位TTG重新配對(duì),繼續(xù)翻譯,從而導(dǎo)致翻譯的蛋白缺失了86和87位的兩個(gè)氨基酸]。TrpLE融合蛋白在大腸桿菌表達(dá)時(shí),其基因內(nèi)部3個(gè)分散的精氨酸AGA密碼子處發(fā)生36%~42%的賴氨酸高效錯(cuò)配,將這些稀有密碼子突變?yōu)榇竽c桿菌偏性的CGC后,錯(cuò)配事件就不再發(fā)生”。這是由于賴氨酰tRNA的反密碼子TTT與AGA密碼子有一定程度的配對(duì)能力,當(dāng) tRNA0M°供應(yīng)不上時(shí)就容易導(dǎo)致錯(cuò)配事件的發(fā)生。

五、結(jié)語(yǔ)

雖然目前還沒有一個(gè)規(guī)則能預(yù)測(cè)特定基因中稀有密碼子能否阻礙基因在大腸桿菌的表達(dá),但通過對(duì)AGG稀有密碼子的研究,人們已經(jīng)獲得稀有密碼子抑制基因表達(dá)的一些規(guī)律。文獻(xiàn)中有時(shí)出現(xiàn)不一致結(jié)果可能是由于多個(gè)因素不同的綜合結(jié)果所致,如位置效應(yīng)、稀有密碼子的聚集或分散存在、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和其他效應(yīng)等。稀有密碼子對(duì)基因表達(dá)的抑制作用可用兩種方法消除。首先是改變密碼子的偏性,通常外源基因的稀有密碼子很多,有的采用全合成基因的方法,有的僅通過改變基因5′端的密碼子偏性就可以獲得在大腸桿菌的高效表達(dá),如綿羊生長(zhǎng)激素和人異酰輔酶A脫氫酶在大腸桿菌的表達(dá);其二是用編碼外源基因中的較多稀有密碼子的同源tRNA基因共表達(dá)的方法來(lái)獲得高效表達(dá)。編碼 tRNAGA或trNA基因的共表達(dá)使一些外源基因在大腸桿菌得到高效表達(dá)(1)。隨著在大腸桿菌表達(dá)的基因數(shù)目的不斷增多,人們對(duì)稀有密碼子的認(rèn)識(shí)將會(huì)越來(lái)越深入,這對(duì)外源基因在大腸桿菌表達(dá)及了解稀有密碼子在基因進(jìn)化中的作用具有重要意義。