正文

癌細胞具有多種染色體畸變。 跨多種不同腫瘤類型的體細胞拷貝數(shù)改變（SCNA）的全基因組研究已經(jīng)證明，特定染色體區(qū)域會表現(xiàn)出更高頻率的DNA拷貝數(shù)增加和擴增，伴隨相關(guān)基因表達增加。以前，組蛋白3賴氨酸9/36（H3K9 / 36）三脫甲基酶KDM4A的過表達和穩(wěn)定化，以及染色質(zhì)狀態(tài)的直接調(diào)節(jié)（即H3K9和K36甲基化），可以導致藥物的位點特異性DNA拷貝增加。這些DNA拷貝擴增是染色體外的，在S期發(fā)生，并且在細胞周期的晚期S /早期G2階段丟失。本研究探討染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑及其相關(guān)的組蛋白修飾狀態(tài)如何影響位點特異性復制和DNA拷貝增加。 通過對賴氨酸脫甲基酶（KDM）進行小干擾RNA（siRNA）篩選，鑒定出了H3K4三脫甲基酶KDM5A在限制TSSG中的作用。 KDM5A消耗和增加的H3K4me3用作KDM4A募集和相關(guān)擴增的信標。 此外，在TSSG中發(fā)現(xiàn)了特定MLL / COMPASS H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶，KDM5A和KDM4A之間的串擾。 此外，還發(fā)現(xiàn)了一個獨立于KDM4A的TSSG站點。 該TSSG受到MT2A / MLL1，KDM5B和KDM4B之間錯綜復雜的相互作用的調(diào)節(jié)。 這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了H3K4甲基化在調(diào)節(jié)TSSG中的關(guān)鍵作用，同時說明了染色質(zhì)修飾因子和局部表觀遺傳狀態(tài)在控制再復制和DNA擴增中有著更廣泛的作用。

KDM5A的消耗促進特定位點的復制擴增

作者對所有賴氨酸脫甲基酶家族（KDM1-KDM7）進行了siRNA篩選（圖1A）。作者還用另一組實驗條件下未經(jīng)歷TSSG的探針，作為陰性對照區(qū)域（染色體8著絲粒，8c）（圖1B，1C）。作者發(fā)現(xiàn)只有KDM5A的消耗導致1q12h拷貝顯著增加，而8c顯示沒有顯著變化（圖1B，1C）。H2591肺癌細胞在KDM5A消耗后也表現(xiàn)出1q12h拷貝增加（圖1D）。 KDM5A的消耗也足以導致其他先前鑒定的TSSG經(jīng)歷拷貝數(shù)增加（即1q21.2和Xq13.1），而染色體1和X上的其他區(qū)域（即1q23.3,1qTel，Xcen）保持不受影響（圖1E）。KDM5i在多個細胞系中引起1q12h拷貝增加的劑量依賴性增加（圖1F，1G）。與KDM5A調(diào)節(jié)TSSG的要求一致，染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析表明，在KDM5A siRNA處理后，TSSG位點的KDM5A顯著減少（圖1H），這表明KDM5A直接結(jié)合這些區(qū)域可以抑制拷貝數(shù)增加。

KDM5A依賴的拷貝擴增是瞬態(tài)的，需要S階段，并且來自重復復制

為了確定KDM5A依賴性擴增是否是瞬時的，我們洗掉了KDM5i并評估了TSSG（圖2A）。在KDM5i處理48或72小時后，RPE細胞產(chǎn)生拷貝增加（無洗脫）;然而，在除去藥物后（洗脫24小時，圖2B，2C），DNA拷貝增加顯著減少。為了確定在S期期間是否產(chǎn)生復制擴增，在接受KDM5i之前，RPE細胞在G1 / S中被羥基脲（HU）處理（圖2D）。用HU預(yù)處理阻斷KDM5i產(chǎn)生DNA拷貝增加（圖2E和S2C）。然而，從HU釋放的KDM5i處理的細胞產(chǎn)生拷貝增加（圖2F），證明KDM5i導致S期依賴性。在純化基因組DNA并通過聚合酶鏈式反應(yīng)（qPCR）定量之前，將每種細胞條件的重 - 重DNA部分合并在一起（圖2G）。我們觀察到在KDM5A耗盡時復制獲得區(qū)域1q12h，1q12 / 21,1q21.2和Xq13.1的重 - 重DNA顯著富集（圖2H）;然而，在1q23.3對照區(qū)沒有觀察到富集。這表明降低的KDM5A水平促進了接受TSSG的部位的重復復制。

KDM5A耗盡促進TSSG生成后S期

作者研究了KDM5A耗盡產(chǎn)生的拷貝擴增是否遵循相同的動力學。在通過DNA FISH分析復制擴增之前，用CDK1抑制劑（CDK1i，Ro-3306）在G2晚期阻止細胞（圖2I）。我們觀察到由KDM5A消耗產(chǎn)生的TSSG在Ro-3306處理后發(fā)生（圖2J）。在KDM5A耗盡后，與對照細胞相比，在G2晚期停滯的細胞在重復復制和拷貝獲得的基因座處富集了DNA Pola，而非復制的基因座沒有DNA Pola富集（圖2K）。此外，我們觀察到在KDM5A消耗后G2中晚期EdU的顯著富集，這表明在G2晚期停滯期間發(fā)生DNA合成（圖2L）?？傊?，我們的觀察結(jié)果支持KDM5A耗盡改變?nèi)旧|(zhì)狀態(tài)的假設(shè)，以便在S期期間發(fā)生重復復制和復制擴增并持續(xù)到G2晚期。

KDM5A相關(guān)的復制擴增需要KDM4A

在KDM5A消耗時經(jīng)歷擴增的區(qū)域中H3K4me3（圖3A）和KDM4A占據(jù)（圖3B）的水平增加，但不在非拷貝獲得的基因座（1q23.3）內(nèi)（圖3A-3B）。 KDM4A的消耗阻斷了用KDM5A耗盡或KDM5i處理觀察到的DNA拷貝增加（圖3C）。 此外，組蛋白H3.3賴氨酸4突變體（H3K4M）的引入消除了由KDM5A耗盡和KDM4A過表達產(chǎn)生的TSSG（圖3E-3F）。 這些觀察結(jié)果說明了將KDM4A招募到經(jīng)歷特定位點重復復制和復制擴增位點的機制。

H3K4KMTs調(diào)節(jié)正在進行TSSG的特定位點

首先，作者進行了KDM5A和KMT2共耗竭實驗以鑒定在TSSG平衡KDM5A調(diào)節(jié)的酶。然后回復由KDM5A耗盡產(chǎn)生的TSSG的KMT在單獨過表達時產(chǎn)生TSSG的能力。通過判定KMT在兩種測定中得分，酶直接參與調(diào)節(jié)位點特異性拷貝增加的可能性增加（圖4A）。在經(jīng)歷TSSG的位點之后，H3K4 KMT的特定亞群與KDM5A保持平衡（圖4A）。在過表達單個H3K4 KMT之前，我們耗盡了KDM4A（圖4B-4I）。在KDM4A消耗后，通過過表達其他H3K4 KMT產(chǎn)生的TSSG被完全或部分拯救（圖4B-4I）。例如，KDM4A的耗盡抑制了SETD1B產(chǎn)生1q12h和1q21.2擴增（圖4B-4C和4E-4F），但僅部分拯救了由KMT2D過表達產(chǎn)生的1q21.2拷貝增益（圖4D）。由KMT2A或KMT2D過表達產(chǎn)生的1q21.3TSSG在KDM4A耗盡時被拯救（圖4G-4I）。這些數(shù)據(jù)強調(diào)需要平衡KMT / KDM表達，以便控制位點特異性DNA擴增。

鑒定KDM4A非依賴性TSSG

在研究KDM4A耗盡是否可以抑制每個KMT驅(qū)動的拷貝增加時，作者觀察到KMT2A過表達導致DNA拷貝增加在1p32.3（圖4G）。該區(qū)域沒有復制KDM4A過表達或KDM5A耗盡導致的擴增（圖5A和5B）。針對KDM5家族成員的siRNA篩選則鑒定出KDM5B是1p32.3 DNA拷貝增加的調(diào)節(jié)劑（圖5A和5B）。此外，應(yīng)用KDM5家族成員的化學抑制則可以產(chǎn)生1p32.3和1q21.3區(qū)域的拷貝增加（圖5C）。為了確定1p32.3拷貝擴增是否是瞬時的，洗掉KDM5i藥物后發(fā)現(xiàn)拷貝增加并返回到基線水平（圖5D和5E）。然后作者證明了KDM5B過表達可阻斷KMT2A產(chǎn)生的1p32.3拷貝增加（圖5F），而不干擾KDM5A調(diào)節(jié)下的其他KMT2A拷貝獲得位點（1q21.3）（圖5F）。 H3K4M的引入也消除了KDM5B-和KMT2A依賴性1p32.3拷貝增加（圖5G-5H）。

1p32.3 DNA拷貝增益需要KDM4B

作者過表達了KDM4A-C家族成員并評估了復制擴增是否發(fā)生在1p32.3位點。僅催化活性的KDM4B過表達導致1p32.3拷貝顯著增加，而1q12h，1q21.3和1q23.3基因座保持不變（圖6A-6C）。此外，KDM4B過表達促進DNA FISH探針覆蓋的1p32.3區(qū)域內(nèi)的再復制（圖6D）。KDM4A與MCM蛋白和DNA聚合酶相互作用（圖6E）。此外，在這些較大復合物中的多個亞基上觀察到KDM4B與MCM和DNA聚合酶亞基之間的能量轉(zhuǎn)移程度不同，這表明KDM4B與這些蛋白質(zhì)復合物結(jié)合（圖6E）?？傊?，這些結(jié)果表明KDM4B直接與復制機制相關(guān)聯(lián)，以促進1p32.3區(qū)域的重復復制和拷貝增加。由于KMT2A以KDM4A依賴性方式促進1p32.3 DNA拷貝增加（圖4G），作者研究了KMT2A產(chǎn)生的拷貝的增加1p32.3是否需要KDM4B。 KDM4B耗盡消除了KMT2A產(chǎn)生的1p32.3拷貝增加，證明KDM4B對于KMT2A產(chǎn)生的拷貝增益是必需的（圖7A）。 KDM4B也是KDM5B消耗產(chǎn)生的拷貝增加所必需的，而KDM4A消耗對1p32.3拷貝增加沒有任何影響（圖7B）。與該觀察結(jié)果一致，用KDM5i處理產(chǎn)生的1p32.3也被KDM4B耗盡阻斷（圖7C）。此外，H3K4M突變體的引入消除了由KDM4B過表達產(chǎn)生的1p32.3拷貝增加（圖7D），這表明染色質(zhì)上的KDM4B募集通過H3K4甲基化發(fā)生。NanoBRET測定證明表達H3K4M的細胞在體內(nèi)具有與染色質(zhì)相關(guān)的KDM4B減少（圖7E和7F）。通過ChIP，作者發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定過表達時，在重復序列位點觀察到KDM4B富集（圖7G）。引入K9M和K36M可導致1q12h，1q21.2和1q21.3區(qū)域的拷貝增加（圖7H）。

小結(jié)

組蛋白賴氨酸甲基化動力學控制位點存在特異性DNA擴增。H3K4甲基化平衡調(diào)節(jié)KDM4A靶向復制擴增的位點。賴氨酸甲基化酶 - 去甲基化酶網(wǎng)絡(luò)指導不依賴KDM4A的拷貝擴增。H3K36甲基化控制位點特異性拷貝增加，是不依賴于H3K9甲基化。