編者導(dǎo)語

成體干細(xì)胞的維持與功能發(fā)揮高度依賴其所在的微環(huán)境，干細(xì)胞與微環(huán)境之間的互作（Crosstalk）是成體干細(xì)胞領(lǐng)域經(jīng)久不衰的研究熱點(diǎn)。作為青春期才開始發(fā)育的器官，乳腺的發(fā)育受到了激素等的精準(zhǔn)調(diào)控。盡管在過去幾十年里人們對(duì)于乳腺發(fā)育的干細(xì)胞樹已逐漸闡明清楚，但對(duì)于微環(huán)境與乳腺干細(xì)胞之間的關(guān)系還尚未完全闡明。最近，Science發(fā)表了普林斯頓大學(xué)康毅濱課題組的一篇Research Article，揭示了Dll1（Notch配體）介導(dǎo)了乳腺干細(xì)胞與微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的互作——即：1. 乳腺干細(xì)胞表達(dá)Dll1（作為關(guān)鍵的信號(hào)分子）--->2. 直接激活周圍巨噬細(xì)胞的Notch通路，增強(qiáng)Wnt因子的表達(dá)--->3. 來自巨噬細(xì)胞的Wnt因子（以旁分泌的形式）促進(jìn)乳腺干細(xì)胞自我更新。這項(xiàng)研究首次證實(shí)了乳腺組織中巨噬細(xì)胞對(duì)乳腺干細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，參與乳腺發(fā)育與穩(wěn)態(tài)維持。

關(guān)鍵詞：乳腺干細(xì)胞；巨噬細(xì)胞；Dll1；Notch通路；Wnt通路

論文簡(jiǎn)介

摘要

    The stem cell niche is a specialized environment that dictates stem cell function during development and homeostasis. Here, we show that Dll1, a Notch pathway ligand, is enriched in mammary gland stem cells (MaSCs) and mediates critical interactions with stromal macrophages in the surrounding niche. Conditional deletion of Dll1 reduced the number of MaSCs and impaired ductal morphogenesis in the mammary gland. Moreover, MaSC-expressed Dll1 activates Notch signaling in stromal macrophages, increasing their expression of Wnt family ligands such as Wnt3, Wnt10A, and Wnt16, thereby initiating a feed back loop that promotes the function of Dll1+ MaSCs. Together, these findings reveal functionally important cross-talk between MaSCs and their macrophageal niche through Dll1/Notch-mediated signaling.

Working model

PMID: 29773667； DOI: 10.1126/science.aan4153

主要發(fā)現(xiàn)

一、乳腺形態(tài)發(fā)生需要Dll1

        文章首先通過基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)Dll1主要在basal（P4, Lin^?CD24⁺CD29^hi）細(xì)胞中表達(dá),而在luminal（P5, Lin^?CD24⁺CD29^lo）和stromal-enriched（P6, Lin^?CD24^loCD29^lo）細(xì)胞中低表達(dá)。而basal細(xì)胞已被報(bào)道富含乳腺干細(xì)胞（MaSC），這些數(shù)據(jù)提示了Dll1在MaSC中可能存在調(diào)節(jié)作用。

    于是，他們構(gòu)建了在basal和luminal細(xì)胞中條件性敲除Dll1的小鼠Dll1^cKO（K14-Cre/Dll1^f/f），發(fā)現(xiàn)與同窩野生型小鼠相比，Dll1^cKO小鼠的乳腺導(dǎo)管伸長(zhǎng)和分支顯著降低，Ki67和EdU染色顯示在Dll1^cKO 乳腺中增殖性乳腺上皮細(xì)胞（MECs）較少。

二、Dll1對(duì)于維持MaSC數(shù)量至關(guān)重要

由于Dll1主要在basal細(xì)胞中表達(dá)，而basal細(xì)胞富含乳腺干細(xì)胞，接下來研究人員開始研究Dll1^cKO 小鼠的MaSC的數(shù)量和功能。FACS分析顯示Dll1^cKO小鼠中富含MaSC的P4群體顯著降低。限制稀釋清除的脂肪墊復(fù)育測(cè)定也顯示從Dll1^cKO小鼠獲得的譜系陰性活細(xì)胞（Lin-，即CD31-，Ter119-和CD45-）的再次繁殖頻率顯著減少，而在移植前通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)在MEC中過表達(dá)Dll1則增加了MaSC的再增殖頻率。令人驚訝的是，WT和Dll1^cKOP4細(xì)胞之間沒有觀察到顯著差異。研究表明Dll1對(duì)于維持乳腺發(fā)育不同階段的MaSC數(shù)量至關(guān)重要。

三、Dll1+細(xì)胞富集MaSCs

為了進(jìn)一步研究Dll1在乳腺中的功能和表達(dá)，他們使用了Dll1-mCherry轉(zhuǎn)基因小鼠模型。結(jié)果表明，在乳腺中，Dll1-mCherry報(bào)告基因在所有發(fā)育階段主要表達(dá)于基底細(xì)胞。FACS分析表明大約12％的Lin-細(xì)胞在virgin小鼠中是Dll1^mCherry陽性的,且Dll1^mCherry 表達(dá)主要富集在P4群體的右上部分，P4-Dll1⁺細(xì)胞具有更高的再增殖頻率，這表明Dll1⁺細(xì)胞代表了富含MaSC的群體的一個(gè)子集。此外，P4-Dll1^hi 基底細(xì)胞相對(duì)于P4-Dll1^low基底細(xì)胞具有增加的重建潛力?；蚪M富集分析（GSEA）證實(shí)P4-Dll1^hi 細(xì)胞富含MaSC特征，而P4-Dll1^low 細(xì)胞富含luminal特征。以上結(jié)果支持了支持Dll1在MaSC細(xì)胞中富集的觀點(diǎn)。

四、富含Dll1+的MaSCs可產(chǎn)生basal和luminal細(xì)胞

為了檢測(cè)乳腺發(fā)育過程中Dll1+細(xì)胞的功能，他們使用了Dll1-GFP-IRES-Cre-ERT2小鼠模型進(jìn)行了譜系追蹤實(shí)驗(yàn)。與在Dll1^mCherry小鼠中觀察到的類似，Dll1^GFP 主要在基底細(xì)胞中表達(dá)。為了追蹤Dll1^GFP+ 細(xì)胞的命運(yùn)，將Dlll-GFP-IRES-Cre-ERT2小鼠與tdTomato報(bào)告小鼠交配，得到的P0代用他莫昔芬初始誘導(dǎo)后在不同時(shí)間點(diǎn)追蹤tdTomato表達(dá)，在早期時(shí)間點(diǎn)（誘導(dǎo)后2天）的FACS分析顯示tdTomato主要在基底細(xì)胞中表達(dá)。3D全局染色和共聚焦成像進(jìn)一步證實(shí)了K14⁺K8^?基底細(xì)胞中tdTomato的表達(dá)。在誘導(dǎo)后2周和6周，在basal和luminal細(xì)胞中均觀察到tdTomato表達(dá)，表明Dll1+細(xì)胞可產(chǎn)生兩種譜系。譜系追蹤也證實(shí)Dll1+細(xì)胞在懷孕第14.5天時(shí)可產(chǎn)生basal和luminal tdTomato⁺細(xì)胞。

五、乳腺巨噬細(xì)胞具有獨(dú)特的分子特性，受Dll1+MaSCs調(diào)控

由于Notch信號(hào)參與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，研究人員接下來想要確定MECs中的Dll1敲除是否影響乳腺中的特定基質(zhì)細(xì)胞群。與野生型腺體相比，FACS分析顯示Dll1^cKO乳腺中的F4/80⁺ 巨噬細(xì)胞減少且PDGFRα⁺ 成纖維細(xì)胞群有輕微減少，而CD31⁺內(nèi)皮細(xì)胞沒有觀察到顯著差異。免疫染色進(jìn)一步證實(shí)在不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)Dll1^cKO 末端芽（TEBs）和導(dǎo)管中的F4/80⁺   巨噬細(xì)胞減少，并增加巨噬細(xì)胞的凋亡活性。3D體外共培養(yǎng)系統(tǒng)的乳腺切片和乳房球的免疫熒光分析證明Dll1+基底細(xì)胞位于F4/80⁺ 基質(zhì)細(xì)胞附近，表明兩個(gè)群體之間存在潛在的相互作用。接著他們又實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了乳腺巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)MaSC活性且P4-Dll1⁺ 細(xì)胞中干細(xì)胞活性的增強(qiáng)更顯著于P4-Dll1^- 細(xì)胞，表明MaSCs依賴Dll1響應(yīng)乳腺巨噬細(xì)胞。

六、去除巨噬細(xì)胞降低了Dll1+MaSCs的功能

為了研究MaSC微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的Dll/Notch依賴性功能，研究人員首先使用氯膦酸鹽脂質(zhì)體（CL）去除Dlll-mCherry轉(zhuǎn)基因小鼠中的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞的消融減少了Dll1^mcherry+MaSC的數(shù)量并增加其凋亡，共移植實(shí)驗(yàn)表明MaSCs對(duì)巨噬細(xì)胞有依賴性。

他們還使用了兩種其他的方法來體內(nèi)消除巨噬細(xì)胞：1）Csf1r阻斷抗體治療和2）巨噬細(xì)胞Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（MaFIA）小鼠。WT小鼠的Csf1r阻斷抗體治療和MaFIA小鼠的AP20187治療均顯著減少巨噬細(xì)胞的數(shù)量，而不影響樹突細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，并極大地阻斷了Dll1⁺ P4細(xì)胞對(duì)乳腺再生的影響，他們還進(jìn)一步使用兩種體內(nèi)模型來研究Notch信號(hào)在巨噬細(xì)胞中維持MaSC活性的重要性。這些研究表明Dll1⁺ MaSC通過Notch信號(hào)傳導(dǎo)實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺巨噬細(xì)胞的功能依賴性。

七、Dll1調(diào)節(jié)相鄰巨噬細(xì)胞中的Notch信號(hào)

他們隨后利用體外共培養(yǎng)進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞和Dll1⁺ MaSC之間的由Dll1介導(dǎo)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)之間的分子連接。研究結(jié)果表明Notch2和Notch3介導(dǎo)MaSCs和巨噬細(xì)胞之間的Dll1依賴性相互作用。為了檢驗(yàn)在MaSC-巨噬細(xì)胞微環(huán)境內(nèi)Dll1-Notch信號(hào)傳導(dǎo)的功能重要性，研究人員再次使用了微球共培養(yǎng)分析。數(shù)據(jù)表明MaSCs和巨噬細(xì)胞之間的由Dll1介導(dǎo)的Notch信號(hào)通路對(duì)于支持MaSC的活性至關(guān)重要。

八、巨噬細(xì)胞Wnt配體的表達(dá)依賴Dll1

        最后，研究人員對(duì)從WT和Dll1^cKO乳腺分離的F4/80⁺ 巨噬細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)在差異表達(dá)的基因中有三個(gè)Wnt配體：Wnt10A、Wnt16和Wnt3。qRT-PCR和免疫熒光分析共培養(yǎng)體系中的Wnt3、Wnt10a和Wnt16的表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)了巨噬細(xì)胞中Wnt配體表達(dá)依賴于Dll1-Notch2/3。此外，巨噬細(xì)胞刺激P4細(xì)胞的球形成活性可以在很大程度上被Wnt信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑Dkk1（Dickkopf-1）的存在所阻斷。

        這些結(jié)果表明巨噬細(xì)胞對(duì)MaSC細(xì)胞群的調(diào)節(jié)很可能是由巨噬細(xì)胞響應(yīng)Dll1-Notch信號(hào)進(jìn)而增加Wnt配體表達(dá)分泌來介導(dǎo)的。

JC評(píng)論 

一、Cinderella的評(píng)論：

       這是一篇中規(guī)中矩的發(fā)育學(xué)文獻(xiàn)，論述翔實(shí)，采用了大量經(jīng)典的研究手段，通過以往的經(jīng)驗(yàn)及現(xiàn)有的數(shù)據(jù)分析來表明自己新穎的觀點(diǎn)，值得我們學(xué)習(xí)。另外，乳腺癌干細(xì)胞是否也與微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞存在此種cross-talk，值得進(jìn)一步研究。

二、Lee的評(píng)論：

        這篇文章工作量很大、使用了多種基因敲除與敲入的工具小鼠、研究結(jié)果也非常漂亮。通讀全文之后，我想到的幾個(gè)問題是：這個(gè)乳腺干細(xì)胞與巨噬細(xì)胞互作的機(jī)制是否也適用于其它組織的成體干細(xì)胞？微環(huán)境中其它類型細(xì)胞以及其它信號(hào)通路到底起多大作用？最后，本文描述的應(yīng)該屬于一種正反饋機(jī)制（乳腺癌中可能亢進(jìn)），體內(nèi)必然存在某些負(fù)反饋機(jī)制來防止乳腺干細(xì)胞的過度自我更新（乳腺癌中可能存在相應(yīng)的缺失）。