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腫瘤中的轉錄因子和表觀遺傳調控的作用早已被大眾所知，特別是BET家族的BRD4蛋白，能夠識別組蛋白乙酰化，啟動一系列基因表達，其中就包括了關鍵性的原癌基因，MYC轉錄因子（1）?；诖?，BET抑制劑（BETi）也是研究和臨床實驗中著名的小分子，通過抑制BET蛋白的活性抑制MYC為代表的一系列關鍵下游基因表達，從而達到抑制腫瘤的作用。而MYC轉錄因子本身就是最重要的原癌基因之一，已經(jīng)有許多報道能夠直接調節(jié)細胞基本代謝，影響細胞生存（2）。 然而無論是BRD4、還是MYC等腫瘤關鍵基因，由于功能水平上相互需要、相互影響，以及研究手段無法區(qū)分等，導致了之前的研究中對于每個關鍵性腫瘤相關基因直接的調控下游及其功能并不清晰。本研究利用新的手段SLAM-seq，分別分析了BRD4和MYC這兩個蛋白調控的下游基因及其機理，指出BRD4作為組蛋白乙?；痳eader通過調節(jié)Pol2磷酸化影響幾乎所有基因的轉錄；而MYC作為轉錄因子只能特異性的結合和調節(jié)自身下游基因，這一調控的Axis的兩個關鍵蛋白在不同層面上發(fā)揮各自的作用。 LAM-seq，即Thiol(SH)–linked alkylation for the metabolic sequencing of RNA，通過向合成中的mRNA鏈中摻入4-thiouridine (4sU)，使得原本的堿基T被4sU修飾，從而在反轉錄中被錯認為C，導致原本應該為堿基A的位置錯配成為G。然后測序過程中通過分析這些錯配的G，就可以得到新合成mRNA的信息。 1：SLAM-seq分析BRD4功能 首先研究者構建了誘導型降解細胞：植物生長激素誘導啟動（AID）表達的BRD4蛋白（Fig.1A-B），加入水稻來源的F-box蛋白Tir1，能夠降解AID后面的蛋白即BRD4（Fig.1A-B）。如Figure 1A，首先利用植物生長激素IAA處理降解蛋白后，加入4sU，再收集細胞mRNA進行處理和SLAM-seq，分析結果發(fā)現(xiàn)： 1）BRD4降解后轉錄事件下降（Fig.1C） 2）不影響轉錄起始相關TBP1和MED1水平，不影響延伸相關的CDK9, CYCLIN T1, SPT5的水平；轉錄起始相關的Pol2-S5P水平穩(wěn)定（Fig.1D） 3）轉錄延伸相關的修飾Pol2-S2P下降（Fig.1D） 4）Pol2、Pol2-S2P和Pol2-S5P的結合都有所下降（Fig.1E-F） 這些結果證明BRD4對于轉錄的調控并不依賴于CDK9，主要通過控制Pol2磷酸化實現(xiàn)。 Figure 1 2：BET蛋白直接調控轉錄，不依賴于染色質結構和重塑過程 由于高濃度的JQ1（BETi）能夠整體降低所有mRNA的轉錄水平（Fig.2A）、導致敏感細胞系的死亡，因此研究者采用低濃度JQ1，使得轉錄下降有了選擇性（Fig.2B）。其中發(fā)現(xiàn)一系列對BETi處理非常敏感、且抑制在AML中非常重要的基因變化顯著，包括MYC等（Fig.2C）。而CDK9抑制劑NVP-2能夠抑制轉錄的基因，則與JQ1完全不同（Fig.2D-E）。更有趣的是，同時用JQ1和低濃度NVP-2處理細胞，表達譜又同高濃度NVP-2處理比較類似（Fig.2D-E）。 關于BET蛋白的作用，有部分理論認為是與superenhancer結構相關。因此研究者分析了BETi下游基因與包含有SE能夠受到superenhancer調控的基因之間的關系，卻發(fā)現(xiàn)兩者并不重合，甚至于JQ1下調的基因中僅有1/3上面含有SE結構；甚至絕大多數(shù)包含SE結構的基因并不能被JQ1影響表達(Fig.2F-G)。例如：JQ1下調基因MYB并不含有SE；而BRD2含有SE卻不能被JQ1抑制（Fig.2G）。 接下來研究者進一步分析BETi處理與DNA甲基化的關系。分析BETi敏感和不敏感基因TSS附近的ChIP和DNA甲基化測序結果進行聚類和比較分析，發(fā)現(xiàn)GLM類相關度好（Fig.2H-J）。GLM這其中包括了相關性正相關的轉錄因子、修飾，例如REST和H3K27ac（Fig.2I），也包括負相關的因子例如轉錄延伸相關的SUPT5H等(Fig.2I)。這些因子分別處于不同的功能分類中，提示了BETi對于轉錄的抑制是通過位點特異進行，而不是通過同一個或者幾個染色質結構相關因子（Fig.2J）。 Figure 2 3：MYC能夠特異性調控生命活動關鍵基因 轉錄因子MYC是BETi作為抗腫瘤藥物最關鍵的靶點之一。而且MYC本身就是最具盛名的原癌基因之一，在白血病中MYC功能至關重要，有報道稱MYC可以起到廣泛的的轉錄促進功能[3-4]。為了分析MYC直接控制轉錄的基因，研究者同樣構建了一個MYC蛋白誘導降解的系統(tǒng)（Fig.3A-B），并且SLAM-seq檢測了60min內由MYC誘導轉錄的新的mRNA，發(fā)現(xiàn)受影響的mRNA非常特異而不是如BRD4能夠影響general transcription，并且基本都是被下調（Fig.3C）。這說明MYC在此的作用并非廣泛的轉錄促進和轉錄抑制，而是特異性的轉錄激活。MYC能夠影響許多維持細胞生存必須的通路，包括核糖體形成和功能、AMP代謝、嘌呤合成等(Fig.3C-D)，因此MYC的降解會嚴重影響蛋白合成過程、AMP/GMP合成受損以及伴隨著的細胞增殖停滯（Fig.3E-F）。以上結果在其他細胞系中也得到相應驗證（Fig.G-H）。并且尋找出的MYC下游基因與MYC的表達水平也存在很高的相關性（Fig.I-J）。 Figure 3 討論 在生物學和基礎醫(yī)學研究領域，技術革新總能夠帶來新的研究思路，產(chǎn)生有趣且高效的進展。多年前的ChIP-seq，ATAC-seq等等，都是當前表觀遺傳學和轉錄研究中必備手段。本研究中， SLAM-seq作為一種較新的測序方式，被用來分析腫瘤細胞中BRD4、MYC對轉錄活動的調節(jié)，分析特異性的下游基因。未來可以想見，SLAM-seq這一強大手段能夠繼續(xù)用于單一基因下游基因和功能分析，解析例如腫瘤相關關鍵基因的真正功能。 文章來源
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