Co-IP是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，可以確定在生理狀態(tài)下細胞內(nèi)相互作用的蛋白質(zhì)。在蛋白復(fù)合物的研究中，不僅可以用于驗證其存在，還可以發(fā)現(xiàn)新的蛋白符合物。

Co-IP的原理及操作

當(dāng)細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。假如細胞內(nèi)存在XY蛋白復(fù)合物，用X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也被沉淀下來。沉淀經(jīng)多次洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸后離心收集上清，對上清進行免疫印跡（Western blot，WB）檢測Y蛋白的存在，如果Y出現(xiàn)，則說明蛋白X與蛋白Y存在相互作用。

如果Co-IP實驗的目的為驗證兩個已知蛋白之間的相互作用，則也可以分別給兩個已知蛋白融合特定的標簽，利用標簽抗體實現(xiàn)蛋白的沉淀及沉淀復(fù)合物中目的蛋白的檢測。例如，分別使蛋白X及蛋白Y融合HA、c-Myc標簽，利用HA標簽的特異性抗體沉淀HA-X融合蛋白，隨后利用c-Myc標簽的特異性抗體對沉淀下來的復(fù)合物進行c-Myc標簽的檢測，如果存在c-Myc標簽，則說明蛋白X與蛋白Y存在相互作用。

Co-IP實驗對照設(shè)置

為了確保最終得到的結(jié)果是天然狀態(tài)下的相互作用，而不是由于某些方面造成的人工相互作用（也就是“假陽性”），在Co-IP的實驗設(shè)計過程中，需要設(shè)置正確的對照。

假設(shè)Co-IP實驗的實驗組為“磁珠+抗X抗體+靶蛋白X+目的蛋白Y”，則可能出現(xiàn)的“假陽性”及對應(yīng)需要設(shè)置的實驗對照如下表所示：

上述為了避免出現(xiàn)“假陽性”的對照稱為陰性對照，除此之外Co-IP實驗還會設(shè)置一個陽性對照組（Input組），Input組為直接利用抗體X（抗體Y）對細胞裂解液進行WB檢測，驗證細胞裂解液中存在蛋白X（抗體Y）。

在某些Co-IP實驗中，實驗人員會把IP后的上清分別進行蛋白X和蛋白Y的WB檢測，該對照組稱為output組。

利用內(nèi)源性Co-IP實驗為驗證兩個蛋白是否存在已知作用，如果最終的結(jié)果為陽性，則可以證明兩個蛋白之間存在相互作用；但如果結(jié)果為陰性，無法證明兩個蛋白之間不存在相互作用，也有可能是蛋白在細胞內(nèi)表達量低等原因?qū)е隆Ｒ虼嗽谶M行內(nèi)源性Co-IP驗證兩個蛋白是否存在相互作用時，建議先做過表達Co-IP作為對照。

Co-IP抗體的選擇

在進行Co-IP實驗前，需要確認抗體可以用于Co-IP實驗。在Co-IP實驗中，抗體需要識別蛋白的構(gòu)象表位，只能識別線性表位的抗體可能無法將靶蛋白沉淀出來，因此并不是所有的抗體都可以用于Co-IP實驗。另外，用于IP靶蛋白的抗體與用于Weatern Blot檢測目的蛋白的抗體最好是不同種屬的，以避免抗體污染。（為什么最好是不同種屬？）

Co-IP瓊脂糖及磁珠的選擇

瓊脂糖與磁珠都可以作為Co-IP實驗中的固定相將“抗體-靶蛋白-目的蛋白”復(fù)合物從細胞裂解液中分離出來。相較于瓊脂糖，磁珠具有較高的易用性及較低的非特異性結(jié)合，是更加優(yōu)質(zhì)的選擇。

Co-IP結(jié)果驗證

目的蛋白為已知蛋白

目的蛋白為已知蛋白，Co-IP實驗可以驗證兩個已知蛋白是否存在相互作用或者驗證細胞中是否存在該目的蛋白。制備或得到已知蛋白的特異性抗體，利用特異性抗體對IP得到的沉淀復(fù)合物進行

目的蛋白為未知蛋白

目的蛋白為未知蛋白，Co-IP的目的為在細胞裂解液中尋找與已知蛋白相互作用的未知蛋白。由于目的蛋白為未知蛋白，無法得到特異性抗體，因此無法進行WB檢測實驗。此時需要對IP得到的沉淀進行質(zhì)譜分析，將質(zhì)譜分析得到的結(jié)果進一步進行已知蛋白與已知蛋白的驗證實驗。

Co-IP與免疫沉淀（IP）實驗的區(qū)別

免疫沉淀

免疫沉淀是用于抗原檢測和純化的最廣泛使用的方法之一。免疫沉淀（IP）的原理為：針對特定靶蛋白的抗體與樣品（細胞裂解物等）中的靶蛋白形成免疫復(fù)合物，隨后利用Protein A-磁珠或Protein G-磁珠將該免疫復(fù)合物從混合物中沉淀下來。最后將靶蛋白從磁珠上洗脫（如果抗體沒有共價連接到磁珠上或使用變性緩沖液進行洗脫，抗體也會被洗脫下來），并通過SDS-PAGE，Western Blot等手段對洗脫下來的蛋白進行分析。

Co-IP

Co-IP是免疫沉淀的延伸，主要用于蛋白-蛋白相互作用檢測。Co-IP的原理是基于IP反應(yīng)捕獲和純化靶蛋白，如果樣品溶液中存在與靶蛋白相互作用的目的蛋白，也會被一同捕獲及純化得到，隨后利用SDS-PAGE，Western Blot等手段對得到的目標蛋白進行分析（查看詳細Co-IP實驗原理）。

通常，判斷一個實驗是IP實驗還是Co-IP實驗，只需判斷實驗的研究重點是靶蛋白（IP沉淀下來的蛋白）還是目標蛋白（相互作用蛋白）。