1. 在無外泌體的血清中培養(yǎng)細胞，因此，任何細胞培養(yǎng)液中添加的血清在4 ° C下離心120，000xg離心過夜后才能使用。 

2. 將細胞懸液錐形管。 

3. 在4 ° C沉淀細胞，離心10分鐘300 XG。 

4. 轉(zhuǎn)移上清到超速離心機管，如果不徹底加入PBS。

5. 樣品16 500 XG離心20分鐘，4 ° C至進一步去除細胞和細胞殘骸。 

6. 通過0.2微米過濾除去大于200納米的顆粒來過濾上清液。 

7. 過濾上清液轉(zhuǎn)移到新的超速離心機管和120 000 XG ，在4 ° C下120，000xg離心70分鐘。

8. 棄上清。 

9. 重懸：這個緩沖液取決于以下目的，例如，裂解液用于蛋白質(zhì)和RNA的分離，PBS是用于電子顯微鏡和流式細胞儀和功能的研究。 

從視頻大家可以看到，這種塑封管挺不方便的，一會要封，一會兒要剪，所以實際，很多都是使用以下這種pc管。

注;外泌體也可以從不同的體液，如血漿，使用相同的過程，作為細胞培養(yǎng)基中分離。對于粘性液體，它可能是必要的，用PBS稀釋的樣品離心和過濾步驟之前的。在上述5點的離心速度，它可以增加至29 500 XG，第7點中的離心可以延長至90分鐘。 

1. 為了進一步消除污染蛋白，在4 ° C下離心120 000 XG 70分鐘，至重新沉淀外泌體富集在PBS中

2.取蛋白分離和總蛋白測定樣品的小等分。確保只有一小部分樣品裂解和蛋白質(zhì)測量，并保存完整的外泌體，PBS溶解，單獨的冰或在-80℃為進一步的實驗。

3.將一滴約10μg的外泌體蛋白在PBS中重新懸浮在PBS中。然后，用鑷子輕輕地將Falvar碳涂層鎳網(wǎng)格放置在每個滴的頂部30-60分鐘。確保柵格定位在涂層側(cè)面對含有脫落物的外泌體。

4.在Parafile上滴三滴PBS，每滴30μL，然后依次將網(wǎng)格定位在PBS滴的頂部來清洗網(wǎng)格，并在兩者之間使用吸收紙。輕輕地將吸收紙輕輕地放在格柵的側(cè)面，而不與涂布區(qū)域接觸。

5.將樣品滴入2%聚多聚甲醛上，將網(wǎng)格放置10分鐘。

6.在用合適的抗體進行免疫染色之前，重復第4點的洗滌步驟。常用的抗體是抗CD63和抗MHC II類。電鏡檢查也可以進行，而不用免疫染色，因為外滲體可以只根據(jù)大小和形態(tài)來鑒定。然而，我們建議評估膜蛋白的大小、形態(tài)和存在，以進行更確鑿的驗證。

7.將網(wǎng)格轉(zhuǎn)移到選擇的初級抗體的30μL滴中，孵育40分鐘。通過重復點4洗滌，但使用0.1%的牛血清白蛋白PBS溶液代替PBS。

8.重復第7點，但與10納米金標記的第二抗體和單用PBS洗。 

9.在樣品上滴入2.5%的戊二醛后固定樣品，然后將格子放在滴狀物上溫育10分鐘。重復洗滌點4，但使用五滴去離子水代替三滴PBS。

10.將樣品中添加2%的醋酸鈾酰滴到藥膜上，將培養(yǎng)液滴在液滴上15分鐘。

11.將0.13%的甲基纖維素和0.4%的乙酸鈾酰滴入膜中，嵌入樣品，并在滴頂部孵育網(wǎng)格10分鐘。

12.用吸收紙輕輕地除去多余的液體，然后將格子放在有涂層的一面朝上的紙上，讓紙風干5分鐘。

13.用電子顯微鏡檢查制劑或?qū)鸥駜Υ嬖跂鸥裣渲幸詡鋵砉ぷ鳌?/span>

由于外泌體太小，不能用目前的流式細胞儀檢測，因此有必要首先將外源體結(jié)合到抗體包被的珠子上（圖1）。這些珠子既可以作為現(xiàn)成產(chǎn)品購買，也可以在實驗室中用抗體選擇。根據(jù)外體細胞的來源，不同的抗體可以結(jié)合到珠子上，珠子可以是磁性的，也可以是乳膠狀的。我們目前使用抗MHC II類或抗-CD63涂層珠用于此分析。

1.使用自制抗體包膜珠，用4μm乳膠珠涂覆抗CD63抗體。將25μL的4μm乳膠粒（30x 106粒）在100μLMES緩沖液中洗兩次，3000x g洗15-20分鐘，再溶于100μLMES緩沖液中。用相同體積的MES緩沖液制備體積等于12.5μg抗體的抗體混合物。在抗體混合物中加入珠子，并在室溫下在夜間攪拌。用PBS(3000x g，20分鐘)將抗體包被珠洗三次，然后將顆粒溶解在100μL的儲存緩沖液中(最終濃度為300000珠/μL)。

2.對于每個樣品(每個抗體)，繼續(xù)以每~10萬個抗體包被的珠子至少等于30μg(在PBS中溶解的完整的外體蛋白)的體積。

3.在4°C下，在溫和的運動下，在300μL PBS的總體積下孵育外體和珠。

4.加入300μl 200 mL甘氨酸，孵育30分鐘。

5.在洗滌緩沖液（PBS中1-3%血清）中洗滌兩次外泌體珠配合物，600×g 10分鐘。

6.在4℃下用50μLIgG抗體孵育外泌體-珠復合物，在洗滌緩沖液中洗滌外泌體-珠復合物兩次，如步驟5所述。

7.將90μL的洗滌緩沖液和10μl的選擇性抗體（理想情況下是抗CD9、抗CD63或抗CD81）加入外體珠復合物中，在溫和運動下孵育40分鐘。如步驟5所述，在洗滌緩沖液中洗滌兩次外泌體珠配合物。

8.添加300μL洗滌緩沖液，用流式細胞儀采集數(shù)據(jù)。如上所述，可以使用不同的珠子，如在協(xié)議或磁珠中描述的乳膠珠。如果使用磁珠代替，請注意，協(xié)議略有不同。不需要阻塞步驟(點4)，并且通過將管置于磁性支架中而不是通過離心進行洗滌。用于“自制”抗體包被珠的儲存緩沖液在PBS中含有0.1%甘氨酸和0.1%疊氮鈉，pH為7.2。重要的是，確保使用流式細胞儀洗滌緩沖液（PBS中1-3%的血清）的耗盡外泌體血清，以避免任何血清外體污染分析。

注意：當使用抗體偶聯(lián)珠進行外泌體特征化時，重要的是要承認它只是被分離和特征化的特定亞群，對所使用的抗體具有特異性。

 Western blot是一種已經(jīng)建立的方法，我們不會詳細介紹該方法本身，而是在Western blot和所使用的不同抗體之前，著重于合適的蛋白質(zhì)分離的重要性。

1.在選擇的蛋白質(zhì)裂解緩沖液中溶解外泌體顆粒，渦流。為了進一步溶解外泌體，可將樣品在水浴3×5分鐘內(nèi)用渦流混合在其之間進行超聲處理。最后將樣品離心，室溫下離心13000×5分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的Ep管中。

2.用選擇的方法測定總蛋白，每孔裝載20-50μg蛋白質(zhì)。

3.通過凝膠電泳和電烙印分離和轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。

4.在對富含外泌體的蛋白質(zhì)進行免疫染色之前，阻斷并洗滌膜。

5.通過化學發(fā)光、數(shù)字成像系統(tǒng)和分析軟件檢測特異性蛋白。

由于沒有外泌體特異性標記，富含來自所有不同細胞來源的外源體的蛋白質(zhì)通常用于外泌體檢測。這些蛋白例如跨膜蛋白(例如CD9、CD63和CD81)和涉及多泡生物發(fā)生的蛋白(例如Tsg101和alix)。其他在外泌體中也普遍檢測到的蛋白質(zhì)是Flotillin、Hsc70和不同的rab蛋白等。然而，在外泌體中也發(fā)現(xiàn)了細胞特異性蛋白，如A33(腸上皮細胞)、CD3(T細胞)和MHC II類(抗原呈遞細胞)。因此，取決于從檢測到的標記物釋放的外來細胞的細胞類型可能有所不同。

由于細胞的其他隔室也可以產(chǎn)生囊泡，因此還建議確定來自這些隔室的蛋白質(zhì)的存在，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(例如calnexin和Grp78)和高爾基體(例如GM130)。因此，缺乏這些蛋白質(zhì)表明沒有或幾乎沒有污染的囊泡中的其他研究的樣品。

在選擇的RNA裂解緩沖液中溶解外泌體顆粒并進行RNA提取。不同的RNA提取試劑盒可根據(jù)下游的實驗，但基于列的方法提供樣品與一個廣泛的RNA。我們目前使用mircury RNA提取試劑盒由Exiqon，但其他組件可能適合手頭的科學問題。

當進行RNA分離時，在無RNase環(huán)境中工作是很重要的。因此，使用核酸和無核酸酶的移液管提示，同時清除工作臺和設備，不受污染物和RNase的影響。

1.RNA的分離，利用mircury RNA提取試劑盒，外泌體顆粒在350μL裂解液進行15秒的混合渦。

2.加入200μL的95%乙醇和渦流混合10秒。

3.在收集管中放置柱，并將裂解的外泌體轉(zhuǎn)移到柱上，離心1分鐘，在14×000克。

4.添加400的μL洗液含有胞外體RNA和離心1分鐘14 000 x g柱洗三次

5.離心柱2分鐘14 000 x g確保柱干燥的地方干柱在無RNA酶的Eppendorf管。

6.將50μL洗脫緩沖液加入到柱中，在200×g下離心2分鐘，然后在14×000×g下1分鐘。

7.繼續(xù)分離RNA或儲存在80°C。

8.對提取的總RNA的檢測和分析外泌體，使用Agilent 2100生物分析儀與

RNA 6000納米或RNA 6000 Pico試劑盒。

外泌體太小，不能用現(xiàn)有的流式細胞術方法檢測，因此在分析之前被附著在抗體包被的珠子上（圖1）。

由于外泌體復合物可以聚集，流式細胞儀散點圖可以包含不同種群的單珠、雙珠和三珠（圖2A）。箭頭表示進一步分析的單個珠子。圖2B顯示了CD63陽性的單珠外泌體細胞群體與其同種型對照相比。

由于外泌體的小尺寸，它們只能用電子顯微鏡直接觀察，而不是通過光學顯微鏡觀察。外泌體的典型形態(tài)特征是圓形和30～100nm大小的膜囊泡。在圖3中，電子顯微鏡照片顯示用金標記的CD63抗體（箭頭所示）和非免疫染色的外泌體（B）免疫染色的外泌體（A）。

為了確定分離的囊泡確實是外泌體蛋白并進一步鑒定外泌體蛋白，通常使用蛋白質(zhì)印跡。圖4顯示了鈣內(nèi)毒素缺失的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標記物。這表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡的污染很小。此外，圖4顯示了CD81在外體中的存在，這是通常在外泌體中富集的四聯(lián)棘素。

細胞RNA主要含有核糖體RNA（rRNA），在生物分析儀分析中，它被認為是18S和28SrRNA亞基的兩個顯著峰（圖5A）。然而，由于外體缺乏兩個rRNA峰（18S和28S），并且富含短RNA，如mRNA和miRNA（圖5B），因此外泌體RNA的分布不同。