德國科學家Ugur Sahin及其團隊首次將一種以RNA為基礎的個性化疫苗治療方案應用于人體， 該療法對每位病人基因組上檢測到的突變進行新抗原預測，然后設計個性化疫苗。通常，自然條件下的免疫系統(tǒng)識別癌細胞的效率極低，而他們所提出的這種疫苗能夠激發(fā)免疫系統(tǒng)，以一種靶向性的方式來對抗腫瘤。

免疫治療（immunotherapy）是指機體對抗原的識別能力低下，通過人為的增強或抑制機體的免疫功能來達到治療疾病的目的。自然條件下人體免疫系統(tǒng)識別腫瘤細胞的效率極低，因此德國科學家Ugur Sahin及其團隊介紹了個性化腫瘤疫苗的概念，采用了一種基于RNA的多重表位方法，激活免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤。研究人員利用了10個突變位點的遺傳信息來實現合成過程，使得能夠在幾個地方同時攻擊腫瘤，確保了腫瘤無力進行抵抗。此次研究首次應用在人體黑色素瘤中。

樣品選擇：符合具有完全緩解、部分緩解或疾病穩(wěn)定的惡性黑色素瘤III期或IV期的13位成年人。

實驗及分析方法：

1. 高通量測序

1. 構建DNA和RNA文庫。

2. 制備MZ-γ氨基丁酸-018和匹配的PBMC的全基因組測序的NGS文庫。

3. 使用Illumina TruSeq PE集群套件的v3-cBot-HS對DNA和RNA末端進行測序。

2. 生物信息學和突變檢測

1. 使用Python編程語言實現突變相關數據的分析。

   DNA文庫>150 x 106reads，RNA文庫>75 x 106reads

2.  采用bwa將DNA讀數與參考基因組hg19進行比對。

3. 新表位優(yōu)先排序及選擇

1. 采用基于預測的HLA I類結合進行排序。

2. 基于MHC I和MHC II結合預測來評估靶肽的靶標選擇板。

4. Sanger測序

1. 采用Sanger測序技術對引物進行設計。

5. 體外轉錄RNA的制備

1. 進行體外轉錄RNA的制備，并通過凝膠電泳和微流體毛細管電泳（Experion，Biorad）評估RNA的完整性。

6. 體外刺激PBMCs

1. 對外周血單個核細胞（PBMCs）刺激11天后，通過流式細胞術分析細胞。

7. 酶聯免疫斑點（ELISpot）

1. 對細胞進行ELISpot測定之后，通過ImmunoCapture V6.3軟件進行分析。

   將由突變的RNA或肽刺激的T細胞應答與對照RNA（螢光素酶）電穿孔的靶細胞或未加載的靶細胞進行比較。

8. 多聚體染色和數據分析

1. 用多聚體對細胞表面標記物和活-死細胞染色。

   BD LSR Fortessa SORP上獲得染色后的細胞

9. 細胞內細胞因子染色

1. 對細胞內細胞因子（IL-2 MQ1-17H12，IFNγB27，所有BD和TNFαMab11 Biolegend）進行染色。

   在BD FACS Canto II（Becton Dickinson）上獲得樣品

10. 單細胞分選

1.   采用BD FACS Aria流式細胞儀（BD Biosciences）進行新抗原特異性T細胞的分選

11. 新表位特異性TCR的克隆

1. 進行來自單個T細胞的T細胞受體（TCR）基因的克隆。

2. 采用來自PBMC的總RNA進行TCR-α/β深度測序。

3. 在DNA文庫中使用Typer Toolbox軟件分析測序數據。

   每個樣品的總TCR讀數：1.1×106?1.5×106reads

12. 定量RT-PCR

1. 采用實時PCR系統(tǒng)進行qRT-PCR.

2. 采用定量SYBR Green Real-Time PCR或TaqMan基因表達測定方法制備和分析樣品

13. 免疫組織化學

1. 采用免疫組織化學技術進行抗原抗體反應

2. 對經過計算機斷層掃描和手動預定義后的腫瘤采用計算機圖像分析軟件量化正常組織和壞死區(qū)域。

14. 患者P04中B2M損失的表征

1. 通過手動整理MZ-γ氨基丁酸-018與整合基因組學中的外顯子比對結果來檢測B2M基因座的缺失，并定義B2M上游的刪除起始點。

15. 克隆HLA抗原

1. 將HLA抗原克隆到適當的體外轉錄（IVT）載體中。

16. RNA轉移到細胞中

17. 肽

1. 使用重疊肽庫：具有11個氨基酸重疊并由15mer合成的肽，其覆蓋27mer新抗原序列（每個新抗原4個OLPs）或控制抗原序列。

18. 流式細胞術分析

1. 在BD FACSCanto II分析流式細胞儀（BD Biosciences）上進行流式細胞術分析。

2. 使用FlowJo軟件（Tree Star）的第十版對獲取的數據進行分析。

19. 細胞毒性測定

1. 基于熒光素進行細胞毒性測定。

2. 根據公式計算特異殺傷：

   

20. 細胞凋亡測定

1. 在37℃，5％CO2下，使用IncuCyte Zoom Live-content成像系統(tǒng)將細胞放大十倍。

2. 使用IncuCyte分析軟件分析數據，以檢測和定量每個圖像的凋亡（綠點）細胞。

3. 使用GraphPad Prism軟件繪制平均綠點數（凋亡數）。

a. 通過免疫接種廣泛動員突變特異性免疫

 圖1 通過免疫接種廣泛動員突變特異性免疫

①觀察到疫苗經皮正常給入人體后，在自身樹突細胞的ELISpot測定讀數中檢測到60％預測的新表位的反應，表明受試的13位患者中每位患者的T細胞能對抗至少三個突變位點。

②觀察到預先存在的針對三分之一的免疫原性新表位有弱免疫應答，但在接種疫苗后反應明顯增強，而其他三分之二為初次應答，表明疫苗對于腫瘤免疫應答具有刺激作用。

③觀察到免疫原性突變均勻分布在五聚體RNA的五個位置，大多數新表位在CD4 +應答，較小的部分被CD8 +細胞毒性淋巴細胞（CTLs）識別，表明了免疫原性突變位點缺乏位置偏倚。

④觀察到大多數新表位疫苗誘導的反應沒有或很少與用RNA編碼的野生型表位轉染的自體樹突狀細胞（DCs）交叉反應。

b. 通過疫苗接種使具有中樞和效應記憶表型的新表位特異性T細胞快速擴增

 圖2    通過疫苗接種使得具有中樞和效應記憶表型的新表位特異性T細胞的快速擴增

①PBMCs的讀取不需要預先擴增ELISpot中新表位 - RNA加載的自體樹突狀細胞，表明血液中五分之一的免疫原性突變反應在體外無刺激作用，而在接種新表位和共有腫瘤相關自身抗原的患者中新表位應答更強，可能是由于缺乏中樞免疫耐受。

②以活化誘導的γ干擾素-分泌為基礎的單細胞經過分選得到CD8 + T細胞，經過體外刺激與新表位 - RNA負載的自體樹突細胞經過TCR克隆，使用肽沖擊細胞測試編碼鑒定的TCR-α/β鏈的RNA與來自健康體的CD8 + T細胞，然后進行共轉染。觀察得到的新抗原特異性TCR的頻率。在來自患者的接種疫苗前血液樣品的TCR深度測序數據中未檢測到新抗原特異性TCR序列，但在接種后的樣品中含量豐富，證實CTL是首次誘導產生的。

③通過無RNA的樹突狀細胞與染色后的樹突狀細胞進行對照得出T細胞不僅具有弱的PD-1+、效應記憶表型并且還有完全功能的γ干擾素和TNFα伴隨表達對抗原的刺激。

 c.    通過疫苗接種在高復發(fā)風險的黑素瘤患者中進行疾病控制

圖3 通過疫苗接種在高復發(fā)風險的黑素瘤患者中進行疾病控制

①  統(tǒng)計受試患者復發(fā)、治療和無進展的數據以及之后每月對新表位RNA疫苗接種的轉移事件的累計總和， 證明了受試患者有復發(fā)的高風險。

② 通過比對沒有轉移事件的累積觀察時間和事件發(fā)生月數的Fisher精確檢驗，和目標病變的計算機斷層掃描以及ELISpot對P07的疫苗誘導的體外反應，表明新表位疫苗接種前后所有患者的黑色素瘤復發(fā)顯示縱向累積復發(fā)轉移事件（P <>

③ 觀察到P17患者的疫苗誘導T細胞反應，表明疫苗激發(fā)了腫瘤免疫應答。

d.    新表位誘導的CTL反應與P04中B2M缺陷黑素瘤細胞的生長免疫逃逸相關。

圖4 新表位誘導的CTL反應與P04中B2M缺陷黑素瘤細胞的生長免疫逃逸相關

①  針對HLA多聚體檢測接種后病變的血液，和TIL中的兩個新表位的CD8 + T細胞的頻率，在不同條件下HLA刪除和倒置使得基因組映射而導致B2M丟失。通過熒光素酶細胞毒性測定來測量新表位的TCR，最后轉染轉移黑素瘤細胞的B2M。在12例應用后，切除殘留的轉移灶，病理診斷幾乎完全壞死，與預接種黑素瘤標本相比：CD8 + T細胞浸潤、PD-L1染色、免疫激活和炎癥標記物的表達均增加。

由于黑色素瘤具有多基因突變的性質，選用黑色素瘤作為實驗對象讓科學家有充足的機會選擇合適的抗原。在13位接種疫苗的患者中，8人腫瘤完全消失且23個月內無復發(fā)，其余5名患者由于接種疫苗時腫瘤已經擴散，有2人出現腫瘤縮小，其中1人接受輔助治療后腫瘤完全消退，證明了基于突變組學的個性化RNA疫苗的臨床可行性、安全性和抗腫瘤活性。免疫治療發(fā)揮了精準醫(yī)療的極致但是仍面臨挑戰(zhàn)——每個腫瘤都有獨特的“指紋”，要研制出個性化的疫苗需要投入大量的時間與精力。

參考文獻：

[1] Carmen Loquai, ?zlem Türeci,et al.[J].Nature, 2017, 547: 222-226.