全球每年有超過50萬(wàn)新發(fā)宮頸癌病例和25多萬(wàn)宮頸癌死亡病例。約95%的宮頸癌是由人乳頭狀瘤病毒（HPV）持續(xù)感染引起的。雖然大部分HPV感染可以在幾個(gè)月內(nèi)被清除，但某些HPV基因會(huì)持續(xù)表達(dá)并使抑癌基因p53和RB失活，從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性增加及體細(xì)胞突變的積累。除此之外，在某些情況下HPV還會(huì)整合到宿主基因組中。目前，宮頸癌臨床患者相關(guān)亞組尚未確定，致癌風(fēng)險(xiǎn)與組織學(xué)亞型的關(guān)系因HPV類型不同會(huì)有很大的差別，導(dǎo)致這些差別的原因也尚不明確。

從未接受化療或放療的228位宮頸癌患者體內(nèi)獲取冷凍腫瘤組織（Primary frozen tumour tissue）和血液。

1.體細(xì)胞基因組的變異：

①對(duì)192位宮頸癌患者的腫瘤及血液樣本進(jìn)行全外顯子測(cè)序

所有樣本具有至少32Mbp的目標(biāo)外顯子，腫瘤樣本測(cè)序平均深度為49x，普通樣本測(cè)序平均深度為47x。測(cè)序得出樣本中包含43324個(gè)體細(xì)胞突變，包括24551個(gè)錯(cuò)義突變，2470個(gè)無(wú)義突變，9260個(gè)沉默突變。

②通過MutSig2CV算法發(fā)現(xiàn)了14個(gè)顯著突變基因（SMGs），并將SHKBP1, ERBB3, CASP8,  HLA-A 和 TGFBR2確定為宮頸癌的新的SMGs。

結(jié)果：檢測(cè)到PIK3CA, EP300, FBXW7, HLA-B, PTEN, NFE2L2,ARID1A, KRAS和   MAPK1這些已經(jīng)發(fā)表過的宮頸癌的顯著突變基因。E542K和E545K是PIK3CA基因的高頻突變點(diǎn)，在PIK3CA中其他位點(diǎn)突變顯著降低。在膀胱癌與HPV陽(yáng)性頭頸鱗狀細(xì)胞癌的研究中也有類似結(jié)果，但在乳腺癌或其他大多數(shù)癌癥研究中都沒有上述情況。

分析：研究發(fā)現(xiàn)，E542K和E545K突變的核苷酸替換模式與胞嘧啶脫氨酶(APOBEC)的誘變有關(guān)。此外，APOBEC突變量與每個(gè)樣本的突變總量密切相關(guān)，這表明APOBEC誘變是宮頸癌突變的主要突變來源。

③研究發(fā)現(xiàn)每個(gè)腫瘤平均有88個(gè)體細(xì)胞拷貝數(shù)改變，采用GISTIC2.0進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析進(jìn)行驗(yàn)證

鑒定到了26個(gè)局部擴(kuò)增區(qū)域，37個(gè)局部缺失區(qū)域。具有高拷貝數(shù)的亞類大多包含涉及11q22 (YAP1, BIRC2/3) 和7p11.2 (EGFR)  擴(kuò)增事件的鱗狀腫瘤。具有低拷貝數(shù)的亞類大多包含腺癌，并且富集了TGFBR2和SMAD4缺失及ERBB2和KLF5擴(kuò)增的腫瘤。高拷貝數(shù)的亞類和低拷貝數(shù)亞類都具有CD274（PD-L1）和PDCD1LG2（PD-L2）的擴(kuò)增并且顯著相關(guān)（p<>

④通過分析low-pass(n=50)和deep(n=19) coverage的RNA-seq及WGS數(shù)據(jù)來鑒定結(jié)構(gòu)重排

在14例患者中檢測(cè)到22個(gè)候選的結(jié)構(gòu)重排，在全部樣本中檢測(cè)出26個(gè)復(fù)發(fā)性基因融合。RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)有4個(gè)樣本在16p13位置發(fā)生了ZC3H7A-BCAR4的基因融合，具體位置是ZC3H7A中的第一個(gè)外顯子連到了BCAR4中最后一個(gè)外顯子上。

WGS分析顯示在染色體16p13.13上的BCAR4串聯(lián)重復(fù)序列與拷貝數(shù)增加。BCAR4是促進(jìn)細(xì)胞增殖的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，通過激活HER2/HER3通路來提高細(xì)胞增殖從而導(dǎo)致體內(nèi)形成腫瘤。Lapatinib是一種EGFR / HER2抑制劑，可體外抑制由BCAR4驅(qū)動(dòng)的腫瘤生長(zhǎng)，有希望作為BCAR4陽(yáng)性宮頸癌的治療劑。

2.分子亞組綜合分析：

圖二 宮頸癌的多平臺(tái)綜合聚類分析

①使用綜合聚類聯(lián)合潛變量模型（iCluster）整合拷貝數(shù)、甲基化、mRNA和miRNA，突出宮頸癌的分子異質(zhì)性

分析結(jié)果：鑒定出對(duì)應(yīng)于mRNA簇主要被分為三個(gè)聚類：具有角蛋白基因家族成員高表達(dá)的鱗狀聚類(Keratin-high)；具有角蛋白基因家族低表達(dá)的鱗狀聚類(Keratin-low)；腺癌富集聚類(Adenocarcinoma)。KRAS,ERBB3和HLA-A的突變與聚類顯著相關(guān)，高角蛋白亞類中缺少KRAS突變，腺癌亞類中缺少HLA-A突變。SPRR和TMPRSS角化基因家族成員以及3個(gè)SMGs（ARID1A，NFE2L2和PIK3CA）在低角蛋白與高角蛋白聚類之間有差異性表達(dá)。

② 使用可變DNA甲基化探針的無(wú)監(jiān)督層次聚類產(chǎn)生了三組：一個(gè)小的“CpG 島超甲基化”（高CIMP）亞類，一個(gè)中等CIMP亞類和一個(gè)低CIMP亞類。（這三個(gè)亞類的分類被認(rèn)為與EMT（epithelial-mesenchymal transition）分值有很大關(guān)系）

結(jié)果：腺癌亞類中的大多數(shù)樣本都是高CIMP，另外兩個(gè)亞類中都包含中等CIMP與低CIMP的混合。將所有的宮頸癌樣本與TCGA項(xiàng)目中抽取的120個(gè)正常樣本進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)有1026個(gè)沉默基因在腫瘤組織中的甲基化程度大于正常組織。

③PARADIGM綜合拷貝數(shù)，RNA-seq和通路交互數(shù)據(jù)

分析：數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)p53，p63，p73，AP-1，MYC，HIF1A，F(xiàn)GFR3和MAPK信號(hào)可作為區(qū)分鱗狀細(xì)胞癌的重要特征，類似于其他鱗癌。相比之下，腺癌顯示較高的ERα，F(xiàn)OXA1，F(xiàn)OXA2和FGFR1通路的活化。ERα上調(diào)的潛在機(jī)制可能是源于miR-193b-3p的表達(dá)。miR-193b-3p可作為ESR1的直接調(diào)節(jié)物，與在鱗狀細(xì)胞癌中相比，在腺癌中其含量顯著下調(diào)，在基質(zhì)細(xì)胞中有傳導(dǎo)雌激素信號(hào)的作用。

圖三：PI3K–MAPK和TGFβR2通路中體細(xì)胞突變的互斥性

①使用互斥模塊算法（MEMo）識(shí)別互斥基因組改變的致癌網(wǎng)絡(luò)并且檢測(cè)miR-200a / b和EMT基因網(wǎng)絡(luò)的變化

結(jié)果：在調(diào)節(jié)EMT過程中，TGFβ通路與miR-200a / b變化之間存在潛在聯(lián)系。染色體的缺失和突變會(huì)對(duì)受體基因TGFBR2、調(diào)節(jié)基因CREBBP和EP300以及轉(zhuǎn)錄因子SMAD4產(chǎn)生影響，通過觀察鱗狀細(xì)胞癌樣本，發(fā)現(xiàn)它們也很有可能影響由TGFβ驅(qū)動(dòng)的抑制生長(zhǎng)和促進(jìn)凋亡的功能。

分析1：鱗狀細(xì)胞癌的顯著特征是具有miR-200a / b高甲基化和下調(diào)，它們富集于低角蛋白聚類中，表現(xiàn)出ZEB1和ZEB2的顯著上調(diào)，并且與TGFβ信號(hào)通路的改變相互排斥。突變的miR-200a / b樣品的EMT得分比正常樣品更高。由于靶向EMT可能使腫瘤對(duì)小分子抑制劑和細(xì)胞毒性化學(xué)療法更敏感，所以可從這一角度研究該子宮頸癌亞型的治療方法。

分析2：MEMo分析表明在與宮頸癌相關(guān)的治療中，RTK、PI3K和MAPK通路存在顯著差異并且發(fā)現(xiàn)了PI3K和MAPK發(fā)生通路改變時(shí)的相互排斥模塊。然而，在腺癌聚類中存在ERBB2和ERBB3改變同時(shí)發(fā)生的強(qiáng)烈趨勢(shì)，表明這些腫瘤樣本可能通過HER3突變和HER2活化之間的相互作用來表現(xiàn)出異常的HER3信號(hào)，因此研究HER2和HER3的靶向治療可能對(duì)于疾病的治療十分有益。PIK3CA的畸變也傾向于與PTEN體細(xì)胞的突變和缺失共存，這與具有很少拷貝數(shù)改變的子宮內(nèi)膜腫瘤相似，并且表明PI3K通路靶向劑的潛在治療作用。

3.跨癌癥分析

評(píng)估宮頸癌亞型與子宮內(nèi)膜癌，相關(guān)癌基因與激素相關(guān)致癌作用的關(guān)系以及相關(guān)癌基因與頭頸鱗狀細(xì)胞癌之間的關(guān)系。為此，對(duì)宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌（UCEC）和頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行分層聚類。

數(shù)據(jù)分析后，得到三個(gè)聚類：

Cluster1：所有UCEC樣本和大多數(shù)宮頸腺癌，其特征是激素受體基因ESR1和PGR的過度    表達(dá)。

Cluster2：主要是鱗狀宮頸癌，以及27例HNSC（27例均被檢測(cè)為HPV陽(yáng)性）中的23例。

Cluster3：包括極少數(shù)宮頸癌和剩余的4例HNSC，大部分都是HPV陰性。 這表明HPV相關(guān)鱗狀上皮癌在不同解剖部位的相似性。

分析：由于一些樣本的宮頸癌與UCEC細(xì)胞發(fā)生聚集，研發(fā)者們開發(fā)了基因表達(dá)分類器來判斷究竟是宮頸癌還是UCEC。通過該分類器，他們將178例被診斷為宮頸癌的患者中的8例歸為UCEC樣癌，這8位患者中的7例HPV檢測(cè)均為陰性。8位UCEC樣癌患者中的6位屬于腺癌亞類，2位屬于低角蛋白亞類。UCEC樣腫瘤分別占ARID1A，KRAS和PTEN的突變的33％，27％和20％。它們與RPPA激素和miRNA C6簇相關(guān)且只有一個(gè)樣本CIMP和拷貝數(shù)較低。

4.HPV基因型、變異與整合

除蛋白測(cè)定外的所有其他平臺(tái)和綜合分析都是在樣本數(shù)目為178例核心組腫瘤中進(jìn)行。其中，HPV陽(yáng)性169例，A9型120例，A7型45例，HPV陰性9例。所有HPV陽(yáng)性患者均可檢測(cè)到HPV E6和E7癌基因的表達(dá)，它們的產(chǎn)物分別對(duì)p53和Rb的功能蛋白產(chǎn)生抑制作用。研究表明，與A9相關(guān)的HPV陽(yáng)性的腺癌基因沉默率最高。A7型中含有較低的角蛋白亞類和腺癌亞類，大多數(shù)A7型的CIMP較低，并且HPV陰性的樣本在低CIMP亞類形成了一個(gè)亞組，其啟動(dòng)子甲基化水平顯著低于該亞類中其他樣品。

功能表觀遺傳模塊分析：使用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析鑒定HPV陽(yáng)性與HPV陰性宮頸癌間甲基化與基因表達(dá)的逆相關(guān)性，以及HPV陽(yáng)性與HPV陰性的HNSC之間的甲基化水平與基因表達(dá)的逆相關(guān)性。

分析結(jié)果：具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的12個(gè)宮頸癌樣本與11個(gè)HNSC樣本關(guān)系密切。miR-944，miR-767-5p和miR-105-5p是HPV陽(yáng)性和HPV陰性樣本之間差異最顯著的miRNA。與HPV18陽(yáng)性鱗狀上皮癌相比，HPV16陽(yáng)性鱗狀細(xì)胞癌的miR-944表達(dá)也顯著高于miR-375表達(dá)。值得注意的是，與HPV陽(yáng)性腫瘤相比，HPV陰性腫瘤具有更高的EMT mRNA得分并且具有較低的APOBEC誘變特征頻率。

通過全面的分子綜合分析，我們確定了宮頸癌新的基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)特征。綜合不同類型的HPV和分子特征得出三個(gè)聚類：Keratin-low squamous、 Keratin-high   squamous、Adenocarcinoma-rich clusters。ERBB3，CASP8，HLA-A，SHKBP1和TGFBR2是新發(fā)現(xiàn)的宮頸癌SMGs，并將ERBB3（HER3）作為宮頸癌的治療靶點(diǎn)。該團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道在癌癥中涉及BCAR4基因的擴(kuò)增和融合，它可以由拉帕替尼間接靶向。此外，本研究還鑒定了CD274和PDCD1LG2的擴(kuò)增，這兩個(gè)基因編碼常用的免疫治療靶點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)一組特點(diǎn)是已被發(fā)現(xiàn)的KRAS、ARID1A和PTEN發(fā)生突變的HPV陰性的宮頸癌，并且發(fā)現(xiàn)PTEN和潛在的ARID1A蛋白可作為治療靶點(diǎn)。有超過70%的宮頸癌在PI3K和MAPK信號(hào)通路中的一個(gè)或兩個(gè)中基因組發(fā)生突變。 因此，可針對(duì)這些信號(hào)通路研發(fā)治療劑以用于臨床治療。

這是首次報(bào)道是不同類型HPV引起的宮頸癌激活的分子途徑，強(qiáng)調(diào)了HPV的多樣性。總之，這些發(fā)現(xiàn)為深入了解宮頸癌的分子亞型提供了依據(jù)，并有望在臨床上針對(duì)不同分型的宮頸癌患者開發(fā)不同的治療方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] The Cancer Genome Atlas Research Network.  Integrated genomic and molecular characterization of cervical cancer[J].Nature, 2017,  543,378–384.