染色體不穩(wěn)定性（CIN）與腫瘤轉移相關，但其在腫瘤轉移過程中扮演的角色尚不明確。染色體不穩(wěn)定的細胞在細胞分裂后期會發(fā)生染色體錯誤分離，這為靶向探究CIN在癌癥轉移中的作用中帶來了困難。非運動微管解聚驅動蛋白家族KIF2B或KIF2C（也稱作MCAK）過度表達所造成的附著在染色體上的微管的不穩(wěn)定性，能夠直接抑制染色體不穩(wěn)定細胞中的CIN。過度表達KIF2B或MCAK的細胞可以繼續(xù)以非整倍體進行分裂。非整倍體是染色體異常中的一種，因此，可通過這種方法可以直接檢測CIN。

樣本選擇：

從基因型和表型（dbGAP）的數(shù)據(jù)庫中下載具有匹配的原發(fā)性腫瘤和正常組織的79個腦轉移瘤的全外顯子DNA序列數(shù)據(jù)；

研究手段：

• 原發(fā)腫瘤-轉移腫瘤的基因組分析

• 頭頸部鱗狀細胞癌染色體分離分析

• 單細胞核型分析

• FISH分析

• RHOA和RAC1下拉實驗

• 免疫熒光顯微實驗

• Y染色體錯誤分離和FISH實驗

• 在微流體裝置中進行細胞遷移

• 動物實驗

• 患者來源的異種移植實驗

• RNA測序和分析

• 逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應

• 單細胞RNA測序

• 病人生存分析

• 體外侵襲和遷移測定

• 細胞質(zhì)DNA定量分析

人轉移瘤中CIN增多

圖1  人轉移瘤中CIN增多

首先，為了確定CIN是否與腫瘤轉移相關，研究人員用加權的基因組完整性指數(shù)（wGII）作為衡量CIN的指標，研究人員對一個已發(fā)表的79對原發(fā)癌和轉移癌進行了分析。分析發(fā)現(xiàn)轉移瘤中wGII指數(shù)更高（圖1a）。

隨后，對原發(fā)乳腺癌和轉移癌的核型分析發(fā)現(xiàn)原發(fā)癌中均為二倍體，而轉移癌中存在大量的三倍體，并且染色體畸變數(shù)量是原發(fā)性腫瘤的兩倍。核型在二倍體~四倍體之間的樣本染色體畸變是最高的（圖1b,c）。

最后，對局部晚期頭頸部鱗狀細胞癌患者的原發(fā)腫瘤組織學分析揭示，細胞分裂后期染色體錯誤分離與淋巴結轉移發(fā)生率之前存在顯著的相關性（圖1d）。

CIN是癌細胞轉移的驅動者

圖2  CIN是癌細胞轉移的驅動者

為了確定CIN與癌細胞轉移是不是因果關系，研究人員用了人(MDA-MB-231)或小鼠(4T1)乳腺癌轉移性腫瘤模型和人肺腺癌(H2030)，均發(fā)現(xiàn)了染色體錯誤分離的證據(jù)。

過表達的KIF2B或MCAK抑制了染色體錯誤分離，而過表達的顯性抑制MCAK突變體（dnMCAK）促進了染色體錯誤分離。KIF2B或MCAK的過表達不會影響細胞增殖和每個細胞中心體的數(shù)量（圖2a,b）。作為對照，研究人員過表達了KIF2A（驅動蛋白家族成員，缺少著絲粒定位結構域），發(fā)現(xiàn)其影響微管解聚，但對CIN影響不明顯（圖2b）。研究人員將表達MCAK或KIF2B定義為CIN-low,將表達KIF2A或dnMCAK定義為CIN-high。

轉移癌的核型分析顯示了廣泛的非整倍性（≈3n）染色體和核型異質(zhì)性。抑制CIN同時減少了單細胞來源克隆的異質(zhì)性核型數(shù)目和異質(zhì)性核型結構。而CIN-low細胞中一些出現(xiàn)了非克隆性結構異常的染色體染色體數(shù)目異質(zhì)性減少。值得注意的是，CIN-low的細胞仍然維持較高程度的非整倍體核型，但可以穩(wěn)定繁殖。這樣，通過比較染色體上穩(wěn)定的非整倍體細胞與染色體不穩(wěn)定非整倍體細胞，研究人員可以通過實驗研究CIN在轉移中的角色。

研究人員通過給無胸腺小鼠注射MDA-MB-231細胞，使用生物熒光標記追蹤細胞的擴散情況。在轉移上染色體錯誤分離的比率顯著不同：注射CIN-high細胞的小鼠迅速死于轉移性疾病（生存期中位數(shù)70天）；而注射CIN-low細胞的小鼠轉移負擔比較低。生存期中位數(shù)207天。CIN-low的轉移會逐漸衰退，有的會自愈；而CIN-high的細胞會轉移多個器官，進展迅速，導致死亡。人肺腺癌細胞中有類似結果（圖2c-e）。MCAK表達細胞中MAD2過表達減少了部分染色體錯誤分離，并相應的增強轉移（圖2c）。研究人員還實驗發(fā)現(xiàn)，CIN抑制對原發(fā)癌的著床效率無影響。但顯著減少了自發(fā)轉移并延長生存期。

圖3  CIN在原發(fā)腫瘤和轉移灶中的作用相反

然后研究人員評估了注射細胞、原發(fā)癌細胞、轉移癌細胞中的染色體錯誤分離情況（圖3a）。主要使用MDA-MB-231細胞、ER+和TNBC病人的細胞。注射細胞中，無論CIN狀態(tài)如何，轉移細胞中染色體錯誤分離比例更高些，然原發(fā)瘤中CIN水平明顯偏低（圖3b-d）。

間充質(zhì)細胞富含CIN

Bulk RNA-seq分析在CIN-low細胞和CIN-high細胞中共鑒定了1584個顯著差異表達的基因。主成分分析和聚類分析均根據(jù)CIN狀態(tài)分離了樣本。轉移相關和上皮間質(zhì)轉化（EMT）相關基因在CIN-high細胞中顯著富集。CIN-high細胞中最顯著差異表達的基因在功能上與無遠處轉移生存（DMFS）有關。數(shù)據(jù)庫來源的乳腺癌數(shù)據(jù)中的驗證實驗也是類似。

原發(fā)瘤和轉移瘤RNA-seq分析顯示了轉移和CIN-high細胞之間的通路。但是轉移瘤中包含了大量上調(diào)EMT和炎癥相關基因不成比例的聚集在1號染色體。核型分析顯示在注射的細胞和轉移的細胞中，1號染色體均是3份拷貝，而原發(fā)癌中僅是2倍體。這樣在這個模型中，1號染色體丟失是原發(fā)癌生長的一個高頻事件。

圖4  間充質(zhì)細胞富含CIN

然后研究人員分別在3株MDA-MB-231細胞系（2個CIN-low和1個CIN-high），共6,821個細胞，進行了單細胞RNA-seq（scRNA-seq）分析。EMT相關基因聚類分析，根據(jù)CIN狀態(tài)，成功的將大多數(shù)細胞分類（圖4a）。所有表達基因的聚類分析確定了12個亞型。一個亞群被定義為EMT和轉移相關的高表達，并且伴隨著豐富的CIN特征基因。與6%的CIN-low細胞相比，這個亞群45%的是dnMCAK細胞（圖4b）。

CIN產(chǎn)生胞漿DNA

圖5  CIN產(chǎn)生胞漿DNA

為了確認CIN應答途徑，研究人員用scRNA-seq的數(shù)據(jù)，計算基因間的Pearson相關性系數(shù)，確認了2大基因模塊：模塊1與細胞增殖和代謝有關；模塊2與EMT（上皮間質(zhì)轉化）和炎癥相關（圖5a）。而且scRNA-seq和bulk RNA-seq數(shù)據(jù)皆證實了炎癥相關基因、CIN特征、EMT基因間強烈的正相關關系（圖4b，圖5b）。

CIN應答途徑與炎癥反應相關，這個結果出乎意料，并且讓人聯(lián)想到病毒感染。因此研究人員研究了CIN是否將染色體DNA釋放到細胞質(zhì)中，從而引起了抗病毒免疫的炎癥反應。染色體DNA暴露到細胞質(zhì)可能是由細胞核或者微核包膜破裂。研究人員采用NLS–GFP進行活細胞成像，發(fā)現(xiàn)在沒有限制的條件下，CIN和染色體DNA暴露到細胞質(zhì)是沒有相關性的。在CIN-high細胞中甚至有細胞核修復的趨勢。CIN-high僅在限制遷移的時候核破裂更加頻繁，這可能是與它們在轉移過程中模仿受限遷移的能力增強有關。

相反地，CIN-high細胞和轉移來源細胞的微核數(shù)目要分別比CIN-low或者原發(fā)瘤細胞多（圖5c-e）。為了驗證微核易破裂是否和細胞質(zhì)DNA增多有關，研究人員選擇了質(zhì)膜選擇性透過的兩種不同的anti-dsDNA抗體進行細胞染色，在CIN-high細胞中發(fā)現(xiàn)增多的細胞質(zhì)dsDNA和ssDNA。在雙鏈特異核酸酶處理以及DNASE2過表達后dsDNA信號消失（圖5f）。亞細胞分離之后，與CIN-high細胞相比，CIN-low的細胞質(zhì)DNA減少為四分之一（圖5g）。

為了驗證染色體錯誤分離是否提供了細胞質(zhì)DNA，研究人員使用了在染色體穩(wěn)定的大腸癌腫瘤細胞DLD-1中建立的可誘導Y染色體錯誤分離系統(tǒng)。發(fā)現(xiàn)在多西環(huán)素和生長素（Dox/IAA）處理2-3天后，Y染色體進入到微核中（圖5h）。從而證實了細胞質(zhì)DNA來源于高發(fā)生率的染色體錯誤分析。

抑制微核包膜破裂減少了細胞質(zhì)中的雙鏈DNA，不影響染色體分離的錯誤率。實際上，MDA-MB-231細胞心內(nèi)或尾靜脈注釋后，這種過表達減少了轉移（圖5i）。

轉移原于細胞質(zhì)DNA的反應

圖6  轉移原于細胞質(zhì)DNA的反應

在染色體穩(wěn)定的細胞中，細胞質(zhì)dsDNA是非常少的，且可被cGAS–STING通路感知，導致I型干擾素刺激基因（ISGs）的誘導。事實上，在DLD-1中，誘導Y染色體分析導致了OAS2、ISG基因的上調(diào)和β干擾素的增加。目前不確認染色體不穩(wěn)定的細胞如何應對持續(xù)的細胞質(zhì)DNA。抑制微核破裂明顯的減少了cGAS+的相對分數(shù)（圖6a，b）。此外，與通路激活一致，CIN-high細胞展示了增高的水平和SITNG核定位（圖6c）。

細胞質(zhì)DNA能夠激活NF-κ B通路。研究人員發(fā)現(xiàn)了CIN-high中非經(jīng)典NF-κ B通路被激活、NF-κ B通路抑制劑TRAF2減少的證據(jù)。STING的消耗減少了RELB的核定位，導致了EMT和炎癥通路的下調(diào)；而在MCAK表達細胞中cGAMP增加或MAD2過表達增加了細胞核中的RELB基因（圖6d）。

Bulk RNA-seq鑒定了一些非經(jīng)典NF-κ B通路的靶基因（在CIN中上調(diào)）。STING、CIN應答的NC-NF-κ B基因具有很強的相關性。相比之下CIN和I型干擾素靶基因間的相關性較弱（圖5b）。類似地，TCGA數(shù)據(jù)庫中原發(fā)乳腺癌RNA-seq數(shù)據(jù)顯示了在CIN特征明顯的腫瘤中CIN應答NC-NF-κB基因表達量增加（圖6e），并且NF-κ B通路調(diào)節(jié)因子表達量升高，它的CIN應答靶基因與乳腺癌和肺癌生存時間延長有關。相反地，正常型核的NF-κ B或I型干擾素調(diào)控因子表達量增加與預后改善有關。

cGAS被腫瘤細胞通過腫瘤細胞非自主機制在腦轉移中激活。研究人員發(fā)現(xiàn)STING和下游非經(jīng)典NF-κB通路以腫瘤細胞自主的方式介導轉移，減少轉移，延長生存時間。相反地，cGAMP增加促進了細胞的侵襲和遷移（圖6f，g）。這些發(fā)現(xiàn)與EMT中非經(jīng)典NF-κB通路、細胞侵襲轉移的作用相一致。

這篇文章揭示了CIN、細胞質(zhì)DNA感應通路慢性激活和細胞轉移之間的聯(lián)系。除了需要加劇染色體異質(zhì)性作為自然選擇的底物外，還需要持續(xù)的染色體錯誤分離來提供細胞質(zhì)DNA并維持促轉移狀態(tài)。因此，即使是高度非整倍體細胞，抑制CIN也可以減少細胞轉移。STING激活的影響是依賴于上下傳導通路的協(xié)調(diào)激活。

由于染色體不穩(wěn)定細胞存在大量的細胞質(zhì)DNA，正常的炎癥反應恢復為靶向染色體不穩(wěn)定細胞提供了可行的治療策略。

CIN的出現(xiàn)及隨后的耐受性是腫瘤演化過程中的一個重要節(jié)點。研究人員發(fā)現(xiàn)CIN誘導腫瘤細胞從高度代謝狀態(tài)向間充質(zhì)狀態(tài)轉錄移位。轉移瘤的泛基因組分析發(fā)現(xiàn)的這兩種互斥的細胞狀態(tài)解釋了腫瘤形成早期染色體非整倍性的負面影響。同時，該研究還揭示，CIN通過EMT和炎癥驅動腫瘤的轉移。

參考文獻：

[1] Samuel F. Bakhoum,Bryan Ngo, et al. [J]. Nature, 2018,553: 467–472.