基因（蛋白）常見(jiàn)的功能分析方法有：代謝信號(hào)通路（pathway）和GO（Gene ontology，基因本體論）分析。另外還有COG（Clusters of Orthologous Groups of proteins）、蛋白功能域（protein Domain）等分析。

功能分析的應(yīng)用非常普遍，以通路分析為例，其相關(guān)的文獻(xiàn)逐年增加，2015年相關(guān)的文獻(xiàn)有42926篇（圖1所示）。 所以說(shuō)基因功能分析是一個(gè)非常普遍而且重要的分析內(nèi)容。

GO和pathway都是研究基因功能的，那么它們的區(qū)別是什么呢？在這里跟小伙伴們科普一下：GO主要是研究基因功能的，而pathway是研究基因和蛋白功能的，是不是一目了然了？GO功能主要分成三大類(lèi)：BP（生物學(xué)過(guò)程）、MF（分子功能）和CC（細(xì)胞組成）；其中最常用的就是GO BP分析。常見(jiàn)的pathway數(shù)據(jù)由KEGG、Reactome、Biocarta等。

功能分析主要分成兩類(lèi)：功能注釋分析和功能富集分析。

功能注釋分析是指對(duì)基因進(jìn)行GO、pathway的注釋?zhuān)ˋnnotation），例如DDR1基因參與GO:0001558 regulation of cell growth、GO:0007155 cell adhesion、GO:0031100 organ regeneration等20個(gè)生物學(xué)過(guò)程（GO BP）。

功能富集分析是指對(duì)一個(gè)基因集（gene sets）進(jìn)行富集分析，使用超幾何分布算法獲得該基因集中的基因顯著富集的功能。一般會(huì)有一個(gè)顯著性的閾值，例如p<0.05。結(jié)果如圖例所示。

報(bào)價(jià)：有參考基因組的功能注釋/富集分析，每組每種500元；

無(wú)參考基因組的功能注釋/富集分析，每組每種1000元；

圖例： A代表通路圖；B代表差異上下調(diào)基因的GO富集分析；C代表KEGG pathway富集分析； D代表GO和pathway富集分析

案例：膽道閉鎖小鼠模型中肝外膽管和膽囊基因

研究目的膽道閉鎖（BiliaryAtresia，BA）是一種肝內(nèi)外膽管出現(xiàn)阻塞并可導(dǎo)致淤膽性肝硬化天性膽道閉鎖而最終發(fā)生肝功能衰竭的疾患。輪狀病毒可導(dǎo)致小鼠患BA 疾病。因此我們利用輪狀病毒感染新生小鼠構(gòu)建的膽道閉鎖的時(shí)間表達(dá)譜，分析疾病樣本異常表達(dá)基因及其功能作用等，來(lái)闡述膽道閉鎖模型的分子機(jī)制。

方法結(jié)果

一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)樣本設(shè)計(jì)如下：鹽水處理組織的對(duì)照樣本，處理時(shí)間點(diǎn)為3天（Day 3 after normal saline injection，簡(jiǎn)稱(chēng)Day3_NS）、7天（簡(jiǎn)稱(chēng)Day7_NS）、**天（簡(jiǎn)稱(chēng)Day**_NS），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)樣本；輪狀病毒處理組織的實(shí)驗(yàn)樣本，處理時(shí)間點(diǎn)為3天（簡(jiǎn)稱(chēng)Day3_RRV）、7天（簡(jiǎn)稱(chēng)Day7_RRV）、**天（簡(jiǎn)稱(chēng)Day**_RRV），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)樣本。制作芯片。

二、表達(dá)數(shù)據(jù)預(yù)處理及差異表達(dá)分析芯片數(shù)據(jù)首先使用R軟件包RMA法預(yù)處理。隨后將探針轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的gene symbol。對(duì)于多個(gè)探針匹配同一個(gè)gene symbol，取這些探針均值作為基因最終表達(dá)值。

計(jì)算分析Day3_RRV vs. Day3_NS、Day7_RRV vs. Day7_NS、Day**_RRV vs. Day**_NS，三個(gè)對(duì)比組的差異表達(dá)基因。使用R包提供的T檢驗(yàn)的方法計(jì)算差異表達(dá)基因的顯著性P值。并使用BH方法矯正P值（即FDR）對(duì)于每個(gè)顯著差異表達(dá)基因，要求其差異表達(dá)的FDR小于0.05，同時(shí)要求log2FC的絕對(duì)值不小于1。

利用基因表達(dá)值可對(duì)多個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行文氏圖分析，快速篩選出重要基因。我們輸入3個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)基因和基因的log2FC值，觀察3個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)基因的異同。文氏圖分析結(jié)果見(jiàn)圖1。有115個(gè)上調(diào)基因同時(shí)出現(xiàn)在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，但是下調(diào)基因只有1個(gè)。后續(xù)進(jìn)一步分析這116個(gè)基因。

圖1 VennPlex文氏圖分析結(jié)果。0表示contra-regulated，指表達(dá)方向相反的基因，如day3和day7有1個(gè)表達(dá)方向相反的基因

三、差異表達(dá)基因功能富集分析使用富集分析工具分別分析每個(gè)時(shí)間點(diǎn)中上調(diào)和下調(diào)基因分別參與GO功能和KEGG通路。參數(shù)富集基因個(gè)數(shù)count>=2，超幾何檢驗(yàn)顯著性閾值Pvalue<0.05（視為顯著富集結(jié)果）。

VennPlex文氏圖得到116個(gè)差異表達(dá)基因在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)變化方向一致，基因功能富集結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 差異表達(dá)基因的功能富集分析（每種結(jié)果只顯示TOP 5，其余的參見(jiàn)附表）

Category

Term

Count

PValue

GOTERM_BP

GO:0006955~immune response

53

9.85E-29

GOTERM_BP

GO:0006952~defense response

48

5.82E-25

GOTERM_BP

GO:0006954~inflammatory response

31

4.75E-19

GOTERM_BP

GO:0009611~response to wounding

36

3.99E-18

GOTERM_BP

GO:0006935~chemotaxis

20

1.33E-14

GOTERM_CC

GO:0005576~extracellular region

76

4.66E-15

GOTERM_CC

GO:0044421~extracellular region part

37

9.05E-08

GOTERM_CC

GO:0005615~extracellular space

29

1.07E-07

GOTERM_CC

GO:0009897~external side of plasma membrane

15

1.84E-05

GOTERM_CC

GO:0009986~cell surface

18

3.13E-05

GOTERM_MF

GO:0030246~carbohydrate binding

26

3.81E-10

GOTERM_MF

GO:0003823~antigen binding

14

1.31E-09

GOTERM_MF

GO:0004364~glutathione transferase activity

9

1.01E-08

GOTERM_MF

GO:0016765~transferase activity

10

3.27E-07

GOTERM_MF

GO:0030414~peptidase inhibitor activity

15

2.90E-06

PATHWAY

mmu00480:Glutathione metabolism

16

1.84E-13

PATHWAY

mmu00982:Drug metabolism

13

7.82E-08

PATHWAY

mmu00980:xenobiotics by cytochrome P450

11

1.69E-06

PATHWAY

mmu04062:Chemokine signaling pathway

17

2.51E-06

PATHWAY

mmu04623:Cytosolic DNA-sensing pathway

8

2.04E-04注：BP代表生物學(xué)過(guò)程；CC代表細(xì)胞組成；MF代表分子功能；pathway代表KEGG pathway；count代表富集的基因個(gè)數(shù)；p值為超幾何分布結(jié)果。

四、交集基因分析結(jié)合VennPlex文氏圖分析結(jié)果，篩選出在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)方向一致的基因。預(yù)測(cè)分析調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄因子。預(yù)測(cè)分析調(diào)控這些靶基因的轉(zhuǎn)錄因子。我們選擇transfac和jaspar數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的轉(zhuǎn)錄因子和靶基因關(guān)系對(duì)。

圖2 轉(zhuǎn)錄因子和靶基因調(diào)控網(wǎng)路，紅色節(jié)點(diǎn)屬于交集基因，三角形節(jié)點(diǎn)表示轉(zhuǎn)錄因子