圖片來源：pixabay

撰文丨楊心舟

這種頗具潛力的Cas蛋白被稱為BhCas12b，其是從外村尚芽孢桿（Bacillus hisashii）中提取出來，而并非常規(guī)的耐酸嗜熱菌。BhCas12b能在37℃條件下保持酶活性，但會造成非靶向性DNA切除，編輯效率并不高。張鋒通過針對BhCas12b的特定突變，將其進行了改造之后，其展現(xiàn)出了強大的基因編輯效率。在人類細胞系以及人體提取的原代T細胞中都在展現(xiàn)出了優(yōu)秀的編輯能力。

既然是第三代工具，為什么叫V型CRISPR系統(tǒng)呢？我們首先需要了解的是第三代是指第三種可以用于人類細胞的基因編輯工具，而V型指的是Cas蛋白家族的亞型。這是兩種不同的概念。

在CRISPR系統(tǒng)中，基本可以分為2類

第一大類：

包括I型（Cas3）、III型（Cas10）、IV型（Csf1）

這一類系統(tǒng)是由多個蛋白亞基組成的效應子模塊，在細菌和古細菌中已經鑒定的CRISPR/Cas系統(tǒng)中占到約90%，可以靶向RNA或者DNA。從下圖中可以看到除了III型的CRISPR系統(tǒng)都需要依托于模塊蛋白Cas1以及Cas2，同時還包括輔助蛋白質，如執(zhí)行逆轉錄酶功能的Cas4和結構域蛋白的CARF。

第二大類：

這類是我們比較熟知的CRISPR系統(tǒng)，經過改造已經在2013年實現(xiàn)了真核生物基因組的編輯。包括II型（Cas9）以及張鋒在2015年通過序列對比和系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)的V型（Cas12），V型中已經得到開發(fā)的V-A型又稱Cas12a或Cpf1。而今天這篇文獻所說第三代也就是Cas12b或C2c1。

這一類效應子模塊只包含單個蛋白，但這個蛋白較大且包含多個結構域。其占到CRISPR系統(tǒng)中基因座的10%左右，已經在不同的細菌種屬發(fā)現(xiàn)，但是古細菌中難覓蹤跡。II型和V-B型包括tracRNA的組件（用于反式激活CRISPR RNA）。

今天發(fā)表的Cas12b與張鋒團隊此前發(fā)表的Cas9以及Cas12a比較如下：

Cas9系統(tǒng)：Cas9蛋白 雙鏈引導RNA CRISPR RNA（crRNA） tracRNA;包含HNH和RuvC結構域

Cas12a系統(tǒng)：Cas12a蛋白 單鏈引導RNA CRISPR RNA；包含RuvC結構域

Cas12b系統(tǒng)：Cas12b蛋白 雙鏈引導RNA CRISPR RNA tracRNA；包含RuvC結構域

但Cas12b有一個絕對優(yōu)于前面兩者的特點，那就是蛋白小。在基因編輯實驗中，通常都需要借助病毒載體將CRISPR系統(tǒng)轉染到細胞中，蛋白表達基因越小就意味著越容易進入細胞。此前科學界已經在嗜酸耐熱菌中發(fā)現(xiàn)了AacCas12b，但它的最適酶活溫度在48℃左右，顯然這并不適合在37℃的哺乳動物體內進行工作。

因此張鋒選擇了重新尋找更加合適的Cas12b。其通過數(shù)據(jù)庫測序比對分析發(fā)現(xiàn)了27種包含V-B結構域的Cas12b，他們發(fā)現(xiàn)V-B型系統(tǒng)在各種類型的細菌中都有，暗示它的傳遞性會更廣。在多種篩除手段后，實驗結果顯示AKCas12b和BhCas12b在37℃能表現(xiàn)出很強的酶切活性。但實際操作中，將兩個蛋白導入細胞后發(fā)現(xiàn)兩者的敲除效率都低于1%。張鋒通過改變tracRNA和crRNA的聯(lián)結架構后，發(fā)現(xiàn)BhCas12b的酶活能提升至原來的30倍，而AKCas12b幾乎沒有變化。至此基本可以確定BhCas12b是他們想要的最優(yōu)蛋白。

但是在這種活性下，精準度成了問題，實驗結果顯示在37℃時BhCas12b傾向于去切割非目的片段的DNA，也就是常說的脫靶效應。張鋒認為這是BhCas12b的Ruvc端出了問題，讓靶標DNA難以結合定位。因此他們決定對蛋白結構進行改造，他們一共分別對176種蛋白進行了突變，并且分析了其切割效應，其中K846R和S893R的改變會明顯提升切割的活性和準確性。他們推斷，這兩個區(qū)域分布的精氨酸鏈對核酸骨架交互起重要作用，因此這種突變提升了BhCas12b與目標DNA的親和度，促進了DNA切割。

此外，像BhCas12b這種酶活溫度相對于嗜熱菌里的Cas12b已經屬于適冷酶了，這種酶的表面會布滿許多甘氨酸，從而可以增加其酶活和延展性。張鋒也同樣檢測了這些甘氨酸突變的效果，結果顯示，在66中表面甘氨酸中，E837G的突變可以將酶活升至兩倍。

最后他們將上述的三個突變合并到了一個Cas蛋白中，稱其為BhCas12b v4，這種Cas蛋白可以在37℃下完成精準高效的實驗。相較于第一代Cas9和第二代Cas12a，其脫靶率極大降低，在張鋒進行編輯的細胞中，第三代編輯工具的脫靶率為0，而Cas9在9個實驗中有6個出現(xiàn)了脫靶。

張鋒發(fā)表的第三代基因編輯工具可以說是非常完美的，其擁有與Cas9媲美的DNA酶切活性，并且靶標準確性遠超Cas9。只是，已經有人先其一步。中科院動物所在2018年12月就發(fā)表論文表示找到并構建了CRISPR/Cas12b編輯工具。（下圖藍條論文）

從標題來看，兩者幾乎就是做的一件事情——改造后的Cas12b可以成為新一代基因編輯工具。當然Cas12b蛋白的細菌來源以及改造工程并不一樣。中科院動物所李偉和周琪研究員同樣發(fā)現(xiàn)許多嗜酸耐熱菌中的Cas12b酶活溫度在37℃以上，但是他們找到了Alicyclobacillus acidiphilus 中的AaCas12b，其酶活反應溫度異常廣，在31℃-59℃之間都能保持高效酶切反應。他們所做的改造工程是將crRNA和tracRNA整合設計成單獨莖環(huán)，與雙鏈RNA工作，此舉也能極大提高酶活效率。經過改造后其同樣能實現(xiàn)張鋒團隊高效、高準確性的Cas12b結果。

說到CRISPR必定少不了專利之爭，Jennifer Doudna與張鋒曾就CRISPR/Cas9技術爭奪了近數(shù)年，Jennifer先于張鋒提交專利，其認為申請專利應遵循“先遞交者獲得專利”的最新規(guī)則。而張鋒則認為申請呈遞時的舊規(guī)則為“先發(fā)明者獲得專利”，Jennifer只提供了思路而未發(fā)明出來，專利應屬于自己。他在2013年申請了加急專利，2014年獲得批準，此后二者就開展了專利大戰(zhàn)。

直到2017年2月15日，美國專利及商標局終于做出裁決——三名法官一致認為張鋒所在的Broad研究所申請的CRISPR/Cas9基因編輯專利，與加州大學伯克利分校Jennifer的CRISPR/Cas9發(fā)現(xiàn)，并不存在沖突（“no interference in fact”）。換句話說，兩家申請的專利涵蓋并不重復，因此張鋒與Broad研究所繼續(xù)保留在2014年獲批的CRISPR/Cas9專利權。

那么這個第三代工具究竟會不會又引起紛爭呢？就此相關問題《環(huán)球科學》采訪了武漢科技局的相關人員。根據(jù)對話，我們了解到專利申請本身周期較長，通常一個專利申請呈遞上去后正常情況下需要20個月才能審批下來，而動物所申請國際專利的時間跨度可能就更大。在專利發(fā)表之前網(wǎng)絡搜索不到申請內容，因此張鋒有沒有申請專利，目前處于專利申請哪個階段是不可知的。

此外，文獻發(fā)表時間的早晚與專利申請之間沒有必然聯(lián)系，只要專利申請?zhí)峤蝗掌谠谖恼掳l(fā)表前即是有效的。也就是說現(xiàn)在雖然中科院動物所的文獻發(fā)表較早，但是只要張鋒的專利先于其提交上去并被批準，仍然能搶先拿到專利。

況且，從Jennifer當年與張鋒的專利之爭看來，專利的界限定位可以非常小，也就是說只要創(chuàng)新度足夠，是完全可以成為兩個“并不存在沖突”的專利申請。從目前兩篇文獻來看，二者的發(fā)現(xiàn)過程，改造過程，應用方法是完全不一樣的，因此成為互不沖突的專利機會很大。在2018年，李偉和周琪也基于張鋒2015年釋出的第二代CRISPR/Cas12a，創(chuàng)新后發(fā)表了相關專利。

第三代基因編輯工具究竟鹿死誰手還未可知，當然，如果能夠皆大歡喜各捧一個回家是最好的結果。但是，科學競賽也是殘酷的，時間就是勝利這句話在科研領域是至圣名言，畢竟名垂千史的永遠只有第一個發(fā)現(xiàn)者。

參考鏈接：

https:///10.1038/s41467-018-08224-4 Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome

http://science./content/363/6422/88/tab-pdf

https://www.ncbi.nlm./pubmed/26593719/

https://www./science/article/pii/S0092867416316658

https://www./articles/s41421-018-0069-3

http://www.cas.cn/syky/201811/t20181127_4672236.shtml

《環(huán)球科學》2019年2月刊現(xiàn)已上市