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最近做腫瘤細胞培養(yǎng)，遇到了支原體污染的問題，小小經(jīng)驗分享一下。 前一段時間，細胞長得不好，細胞培養(yǎng)液清亮，但是凋亡比較多，后來細胞幾乎不長甚至越死越多。找高手鏡下一看，懷疑支原體污染。用了3種方法鑒定后，確定支原體污染無誤。下面的任務，就是扔細胞，擦洗培養(yǎng)箱，尋找清除支原體的試劑。重新復蘇細胞，都是在再次傳代后又不長了，懷疑過去存的種子細胞也有問題。竟然為了這支原體污染，1個多月忙活，實驗毫無進展。 一、首先我用過LONZA的試劑，好像是發(fā)光法，具體不太確定，價格太貴（一個樣品檢測需要1、2百元）。這個畢竟是大公司，做免疫細胞治療試劑的，應該很可靠；檢測一次需要幾個小時。 二、自己用DAPI或PI染色，熒光顯微鏡下觀察，這種方法需要一定的鏡下識別技術（因為我們并不是經(jīng)常遇到支原體污染，也不是鑒別支原體的檢驗人員），其他劣勢是：比較粗略；少量污染難以看得出來（不過，少量污染細胞也能很好生長，呵呵）。這一方法的優(yōu)點是快速方便，但是需要一臺熒光顯微鏡。 三、后來我根據(jù)文獻，合成了2套PCR引物，一套是巢式PCR引物（內外PCR引物，共計多達7條上下游引物；2次PCR費時費工），另一套是簡單兩條PCR引物。PCR后兩套引物結果一致，只是沒有測序驗證是否是同類型的支原體了（不過也沒必要大動干戈）。 經(jīng)過3種方法的檢測結果的互相確認，感覺最后的這一套引物（簡單的2條引物）既敏感、又客觀，方法簡單，只要有一臺普通的PCR即可。現(xiàn)在我基本上都是用這一方法，PCR和電泳，2小時出結果?！厩耙铮篏GGAGC AAA CAG GAT TAG TAT CCC T 后引物：TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC 】。退火55-60度均可。 但是，如果是做臨床治療的細胞樣品，建議還是用CFDA批準的檢驗試劑，或者公認的公司生產(chǎn)的檢驗產(chǎn)品，來做最后鑒定。 關于清除支原體，買了一個試劑，Biomyco 3，100x的，用了以后細胞渾濁，感覺這一清除劑本身也存在污染。又重新濾過，，今天用它配了200ml完全培養(yǎng)基，換細胞培養(yǎng)液，等待結果。因為看文獻，說要清除支原體，至少需需要14天以上。后續(xù)結果，隨后我會貼上來。 同時，在丁香通上，找了一家公司，可以試用支原體清除劑。結果送來后，只要大約幾十微升（20ul？），記不清了，裝在1.5ml管里，用起來不方便。加如培養(yǎng)液以后也沒有太大起色，細胞只好扔了。 培養(yǎng)箱除支原體：買了一瓶500ml的支原體清除噴劑，但是具體效果，也沒辦法驗證，權當去去心病吧。 感覺這次支原體污染，和培養(yǎng)環(huán)境關系不大。 看到有網(wǎng)友說，支原體污染，難以避免，一般對細胞生長影響不大，尤其是短期培養(yǎng)。我們原來培養(yǎng)的時候，盡管傳了多次代，支原體也沒有瘋狂生長，為什么最近支原體的影響這么明顯，到現(xiàn)在還是個疑惑！??！  返回小木蟲查看更多
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